RORα在肾透明细胞癌中的表达及临床意义

阿衣肯·巴合达提 胡尔西旦·那斯尔 张瑞丽 艾尼瓦尔·艾木都拉

肾细胞癌(renal cell carcinoma, RCC)是十大恶性肿瘤之一,其发病率逐年升高[1]。肾透明细胞癌(clear cell renal cell carcinoma, ccRCC)占RCC病例的70%～90%,是一种侵袭性较强的病理组织学亚型[2]。有研究表明,缺氧和缺氧相关的信号通路在RCC的发生和进展中起着重要作用[3]。随着肿瘤细胞的增殖和生长,导致RCC缺氧,缺氧诱导因子1α(hypoxia inducible factors α, HIF-1α)响应缺氧被活化,并上调缺氧诱导基因的表达[4]。缺氧会上调维甲酸相关孤儿受体α(retinoid-related orphan receptor-alpha, RORα)基因在许多细胞类型中的表达,被证明是HIF-1的直接靶标[5-7]。因此推测RORα有望成为ccRCC治疗的靶标,但其在ccRCC中的作用尚不明确。本研究对ccRCC组织中RORα蛋白的表达水平及其与临床病理特征、预后之间的相关性进行分析,旨在为ccRCC的临床诊断和治疗提供理论依据。

对象与方法

一、临床资料收集与随访

收集2014年12月至2019年12月在我院接受手术治疗的ccRCC患者癌组织及对应癌旁组织标本151例。纳入标准:①患者为首次就诊;②未接受任何方式的抗肿瘤治疗;③经病理组织学或细胞学检查明确诊断为ccRCC。排除标准:①确诊为肾癌,但不属于ccRCC;②随访资料缺失,无法核实其病史等情况;③有抗肿瘤治疗史;④有其他部位的原发恶性肿瘤史。通过调阅住院病历、门诊随访记录以及电话随访,确定患者的死亡、复发时间。以局部进展、死亡为观察终点,最后一次随访时间为2020年2月28日,随访3～62个月(中位时间36个月)。存活患者的生存期按截尾数据处理。手术日期至患者因疾病死亡的时间定义为总生存期,手术日期至患者疾病首次局部复发或者疾病进展的时间定义为无病生存期。

二、免疫组化及评估

将入组的石蜡包埋ccRCC及癌旁组织标本用0.3%(质量分数)过氧化氢溶液清除内源性过氧化物酶(15 min)后,加入1∶100一抗(兔抗RORα多克隆抗体由英国abcam公司提供)50 μl,将样品与兔二抗在室温下孵育30 min。然后用二氨基联苯胺(DAB)染色,并用Meyer's苏木精复染细胞核。染色评分参照文献[8]标准判定,染色强度:0分为无着色或者着色不明显,1分为轻度着色(浅黄色),2分为中度着色(深黄色),3分为重度着色(黄褐色或棕色);阳性细胞数:阳性细胞数0为0分,阳性细胞数≤25%为1分,阳性细胞数26%～50%为2分,阳性细胞数51%～75%为3分,阳性细胞数>75%为4分。将染色强度、阳性细胞数两项的计分相乘,结果>4分判定为高表达,≤4分判定为低表达。

三、统计学方法

使用SPSS 26.0软件进行统计分析。计量资料若满足正态性检验则采用t检验,若不满足则采用非参数检验;计数资料以构成比表示,组间比较采用χ2检验,不满足χ2检验则采用Fisher精确检验;对研究队列随访数据通过Kaplan-Meier法分析,采用Cox回归模型分析影响预后的因素。以P<0.05为差异有统计学意义。

结 果

151例随访患者中,存活144例(95.36%),死亡7例(4.64%),复发21例(13.91%),其中骨转移9例(5.96%)、腹腔转移2例(1.32%)、肾上腺及肾周围组织转移7例(4.64%)、肺转移3例(1.99%)。将ccRCC组织中RORα表达水平按免疫组化评分结果分为高表达组和低表达组,其中64例为高表达,87例为低表达。ccRCC患者癌组织中RORα蛋白高表达率为42.38%(64/151),癌旁组织中RORα蛋白高表达率为68.87%(104/151),与癌组织比较,癌旁组织中RORα蛋白高表达率明显较高,差异有统计学意义(P<0.05),见表1。对ccRCC患者RORα蛋白表达水平与临床病理特征的关系做进一步分析,结果显示RORα蛋白表达与ccRCC患者的性别、TNM分期、Fuhrman分级、肿瘤直径、临床症状、淋巴结转移、体质指数(body mass index, BMI)、碱性磷酸酶(alkaline phosphatase, ALP)水平有关(P<0.05),而与年龄、肿瘤侧别、糖尿病、高血压、吸烟及胱抑素C(cystatin C, CysC)水平无关(P>0.05),见表2。对ccRCC患者的临床资料及生化指标进行多因素Cox回归分析显示,TNM分期Ⅲ～Ⅳ期为患者无病生存期和总生存期的危险因素(P<0.05),同时RORα表达水平与无病生存期有明显相关性(P<0.05),见表3、4。

表1 ccRCC患者癌组织和癌旁组织中RORα表达情况[例(%)]

表2 ccRCC患者RORα表达与临床病理特征之间的关系[例(%)]

表3 多因素Cox回归分析患者无病生存期的影响因素

表4 多因素Cox回归分析患者总生存期的影响因素

讨 论

ccRCC是一种高度遗传异质性的恶性肿瘤,发病隐匿,具有高转移率和高死亡率[9]。转移性ccRCC的治疗以血管内皮生长因子抑制剂和免疫治疗为主,但不同的患者对靶向治疗的疗效均存在较大差异[10],考虑与肿瘤特异性生物标志物有关[11]。因此,发现与ccRCC相关的新靶标是提高患者治疗疗效,实现精准治疗的关键。

RORα作为维甲酸相关孤儿受体亚家族成员之一,通过结合目标基因的特异性DNA反应元件来调节转录,其广泛表达于多种组织中,如脑、心脏、肝脏、肺、胃肠组织和胸腺、皮肤、子宫[12-13]。RORα基因是一个重要的生物钟核心基因,参与人体代谢和昼夜节律的调节,在心血管疾病、慢性炎症、免疫功能低下、细胞应激等病理过程中发挥着重要作用[14-16]。此外,有研究发现RORα在肿瘤的发生过程中起着重要作用[17-18]。在乳腺癌中观察到RORα表达降低,RORα rs7164773 SNP与乳腺癌患者预后较差有关,RORα基因变异增加了患乳腺癌的风险[19]。在肝细胞癌(hepatocellular carcinoma, HCC)中RORα是SORBS2的主要靶点,SORBS2通过直接结合RORα mRNA的3′UTR来减少RORα mRNA降解,并能在体内外抑制HCC细胞增殖、侵袭、迁移和上皮间质转化[20];也有文献提出,miR-1246的上调和RORα的抑制是侵袭性HCC的显著特征,miR-1246-RORα-Wnt/β-catenin轴是加速HCC进展的一种新途径[21]。RORα在人胃癌组织与胃癌细胞系中均低表达,且RORα低表达与胃癌进展和预后不良有关[22]。RORα基因的过表达能够抑制肺腺癌A549细胞的增殖活力,过表达RORα的A549细胞在裸鼠体内中成瘤能力降低,同时还可以激活P53/P21/CyclinB1信号通路[23]。本研究中,免疫组化检测发现ccRCC组织中RORα蛋白表达下降,相较于早期患者(无淋巴结转移及TNM分期Ⅰ～Ⅱ期),进展期患者(淋巴结转移、TNM分期Ⅲ～Ⅳ期)癌组织中RORα蛋白高表达比例更低,这些结果表明RORα低表达患者的疾病进展及转移可能性大,这与其他研究报道结果一致[15-23]。本研究对ccRCC患者RORα蛋白表达水平与临床病理特征的关系做了进一步分析,结果显示RORα蛋白表达与患者的性别、Fuhrman分级、肿瘤直径、临床症状、BMI、ALP水平存在显著相关性(P<0.05),而与患者的年龄、肿瘤侧别、CysC水平以及有无糖尿病、高血压、吸烟无显著相关性(均P>0.05)。本研究中RORα表达与临床症状有关,出现临床症状的患者RORα低表达占比升高,提示更长时间的病程和发生侵犯转移的可能性,由此说明,RORα低表达与ccRCC的恶性病理特征相关即其表达与恶性程度成反比,也符合抑癌基因特点。早期研究已证实肥胖症与众多肿瘤的发生密切相关,几乎一半的肾肿瘤与BMI>30 kg/m2的肥胖有关,BMI每升高5 kg/m2,肾癌风险增加20%～35%[24]。研究表明,超重和肥胖人群患肾癌风险分别增加35%和76%[25],本研究证实BMI≥25 kg/m2的患者RORα表达水平低,所以高BMI患者RORα的低表达性也符合RORα在ccRCC组织中低表达的特征。ALP主要由肝脏和成骨细胞合成,可作为生物标志物来评价肝脏和骨骼的功能。有研究认为ALP可作为预测和诊断恶性肿瘤骨转移有意义的指标[26-27]。本研究151例ccRCC患者中有7例ALP含量偏高(≥216 U/L),均为RORα低表达患者。这也说明RORα低表达患者恶性程度高,容易发生骨转移。

综上所述,RORα蛋白在ccRCC组织中低表达,且与TNM分期、淋巴结转移等临床病理特征相关,其低表达可能增加疾病进展及不良预后风险,有可能作为ccRCC患者诊断、治疗及预后评估中的重要分子指标。