LncRNA HOXB-AS1对乳腺癌MCF-7细胞增殖、迁移、侵袭和凋亡的影响机制研究

王雨珂,田 程,李代龙,许新华

(三峡大学医学院,湖北 宜昌 443000)

乳腺癌是一种异质性疾病,位列全球第2大肿瘤,每年约有220万新发病例,68万死亡病例[1]。目前乳腺癌的治疗方法包括手术、放疗、化疗、内分泌治疗、靶向治疗和免疫治疗[2]。虽然这些治疗方法明显改善了乳腺癌患者的疾病进展、复发风险、总体生存率,但由于其异质性,部分患者疗效显著,部分患者疗效却不明显。此外,药物抵抗、肿瘤转移及复发严重威胁着患者的长期生存状况。

人类转录组学研究显示,超过50%的转录本没有蛋白编码能力,长链非编码RNA(long non-coding RNA,LncRNA)在转录、转录后及染色体水平调控基因的表达,影响机体生理、病理进程[3]。LncRNA存在于外泌体、凋亡小体等囊泡结构中,或与某些蛋白结合分泌至血清、尿液和其他体液中。有研究显示,LncRNA同源异型盒基因B-AS1(HOXB-AS1)在胶质母细胞瘤、子宫内膜癌中表达上调,但在乳腺癌组织及乳腺癌细胞MCF-7、T47-D中的表达下调[4-6]。但HOXB-AS1在乳腺癌发生、发展中的作用目前仍不清楚。本文旨在探讨HOXB-AS1对乳腺癌MCF-7细胞增殖、侵袭、迁移、凋亡的影响,以及对Akt/mTOR通路介导自噬的影响。

1 研究材料与方法

1.1 材料与试剂

1.1.1 人乳腺癌MCF-7细胞的来源

人乳腺癌MCF-7细胞于2020年6月20购自中国科学院分子细胞科学卓越创新中心。

1.1.2 药品和试剂

MEM培养基(Hyclone);胎牛血清(fatal bovine serun,FBS)(Gibco);青霉素-链霉素溶液、Annexin V-FITC细胞凋亡检测试剂盒、胰酶细胞消化液、RIPA裂解液、磷酸酶抑制剂混合物、蛋白酶抑制剂混合物、CCK-8试剂(碧云天);BCA蛋白浓度测定试剂盒、loading buffer、ECL超敏发光液、RNA提取试剂及逆转录试剂(Solarbio);SYBR Select Master Mix试剂盒(ThermoFisher Scientific);基质金属蛋白酶(matrix metalloproteinases,MMP)-2、MMP-9、微管相关蛋白1A/1B-轻链3α(microtubule associated protein 1 light chain 3 alpha,LC3A)、磷酸化蛋白激酶B(phosphor-protein kinase B,p-Akt)、Akt、磷酸化雷帕霉素靶蛋白(phosphor-mammalian target of rapamycin,p-mTOR)、mTOR、糖酵解酶3-磷酸甘油醛脱氢酶(glyceraldehyde phosphate dehydrogenase,GAPDH)兔单克隆抗体(CST);p62兔多克隆抗体(abcam);HOXB-AS1过表达质粒(上海吉凯基因科技有限公司);Lipofectamine 3000(Thermo Fisher Scientific)。

1.2 方法

1.2.1 乳腺癌MCF-7细胞的培养、转染和分组

将MCF-7细胞置于含有10% FBS的MEM培养基中,在37℃的5% CO2孵育箱中培养。将MCF-7分为对照组(Con组,n=3)、阴性对照组(NC组,n=3)和HOXB-AS1过表达组(HOXB-AS1组,n=3)。使用Lipofectamine 3000将阴性对照质粒和HOXB-AS1分别转染至NC组和HOXB-AS1组的MCF-7细胞。对照组的MCF-7细胞不做处理,NC组和HOXB-AS1组的MCF-7细胞转染48h后进行其他处理。

1.2.2 CCK-8法检测乳腺癌MCF-7细胞增殖活力

将MCF-7细胞转染处理后,接种至96孔板,密度为104个/孔。然后将MCF-7细胞放回孵育箱培养24h,加入细胞增殖-毒性检测试剂(CCK-8)10μL/孔,继续孵育1h。在450nM处测定其吸光度(OD)值。

细胞增殖活力=(处理孔OD-对照孔OD)/对照孔OD×100%。

1.2.3 乳腺癌MCF-7细胞的迁移实验

MCF-7细胞分组处理同1.2.1,将MCF-7细胞接种于6孔培养板中,细胞贴壁后加入丝裂霉素处理。当MCF-7细胞融合达到90%后,用200μL的移液枪枪头进行细胞划痕,磷酸盐缓冲液(PBS)漂洗,去除漂浮细胞,然后再无血清培养基中培养,24h后计算细胞迁移率。

细胞迁移率=(0h划痕宽度-24h划痕宽度)/0h划痕宽度×100%。

1.2.4 Transwell实验检测乳腺癌MCF-7细胞的侵袭

将0.5%的Matrigel基质胶加入Transwell小室中,37℃孵育2h。将MCF-7细胞转染处理后,用不含FBS的MEM培养基重悬细胞,取MCF-7细胞悬液(2×104个细胞)接种至Transwell小室上室;然后将含有10% FBS的MEM培养基加入下室中。将MCF-7细胞继续孵育24h后,取出Transwell小室,用95%的乙醇洗涤,并用多聚甲醛固定细胞。漂洗后用0.5%结晶紫染色,并用棉签擦去上室中的细胞,拍照计数细胞数量。

1.2.5 流式细胞仪检测乳腺癌MCF-7细胞的凋亡

将MCF-7细胞按105个/孔接种至6cm培养皿中,转染处理后收集各组MCF-7细胞。MCF-7细胞用0.01mol/L的PBS漂洗后,加入1×Binding buffer重悬细胞。加入Annexin-FITC和PI染色液各5μL混匀,室温避光孵育10min。在1h内使用BD AccuriC6流式细胞仪采集MCF-7细胞数据。

1.2.6 Western blot实验检测MMP-2、MMP-9、自噬及Akt/mTOR通路相关蛋白的表达

收集Con组、NC组和HOXB-AS1组的MCF-7细胞,使用RIPA裂解液冰上裂解细胞提取总蛋白,通过BCA法测定蛋白浓度,将样本95℃水浴处理5min变性;取40μg蛋白样品进行8%～10%聚丙烯酰胺凝胶电泳(SDS-PAGE)。湿法转印至聚偏二氟乙烯膜(PVDF)上,用5%脱脂牛奶室温封闭1h,加入MMP-2、MMP-9、LC3A、Beclin 1、p-Akt、Akt、p-mTOR、mTOR、GAPDH、p62抗体4℃过夜;再加入二抗室温孵育1h,用凝胶成像系统采集图像。

1.2.7 实时定量聚合酶链反应检测HOXB-AS1基因的表达

使用TRIzol提取MCF-7细胞的总RNA,并进行RNA定量。取1μg总RNA使用UEIris Ⅱ RT-PCR System进行逆转录以得到cDNA。利用SYBR Select Master Mix试剂盒在ABI 7900仪器上进行实时定量聚合酶链反应(qRT-PCR)实验。采用2-ΔΔCt计算基因相对表达量。

引物序列:

HOXB-AS1:5′-GGGGACTCCAGCGAAAT-3′(forward),5′-ACCCGAAGCCCAACCAC-3′(reverse);GAPDH:5′-CAGGAGGCATTGCTGATGAT-3′(forward),5′-GAAGGCTGGGGCTCATTT-3′(reverse)。

1.3 统计学方法

2 结果

2.1 各组LncRNA HOXB-AS1相对表达量情况

qRT-PCR实验显示,乳腺癌MCF-7细胞在转染后,Con组的LncRNA HOXB-AS1相对表达量为0.15±0.05、NC组为0.13±0.03、HOXB-AS1组为0.75±0.04,HOXB-AS1组的LncRNA HOXB-AS1相对表达量显著高于Con组和NC组(t=16.030,P=0.000),见图1。

图1 qRT-PCR实验检测MCF-7细胞中LncRNA HOXB-AS1相对表达量的统计

2.2 各组HOXB-AS1对乳腺癌MCF-7细胞增殖的影响

MCF-7细胞经HOXB-AS1处理24h后,CCK-8法检测显示,Con组的MCF-7细胞活力为(100.00±9.13)%、NC组为(100.00±2.94)%、HOXB-AS1组为(60.50±5.72)%,HOXB-AS1组的MCF-7细胞活力显著低于Con组和NC组(t=7.428,P=0.000),见图2。

图2 CCK-8法检测转染HOXB-AS1后MCF-7细胞增殖活力的统计

2.3 各组HOXB-AS1对乳腺癌MCF-7细胞迁移和侵袭的影响

划痕实验显示,转染HOXB-AS1后,Con组的划痕愈合速度为(61.00±3.61)%、NC组为(59.83±2.26)%、HOXB-AS1组为(39.03±3.61)%,HOXB-AS1组的划痕愈合速度显著低于Con组和NC组(t=16.090,P=0.002),即MCF-7细胞迁移能力减弱,见图3。

注:A图为各组划痕实验;B图为各组迁移率的统计。

Western blot实验检测显示,转染HOXB-AS1后下调了MCF-7细胞迁移标志蛋白MMP-2和MMP-9的表达,见图4。

Transwell实验检测显示,转染HOXB-AS1后,Con组的MCF-7细胞侵袭数为(343.36±20.82)个、NC组为(316.00±29.46)个、HOXB-AS1组为(105.02±15.00)个,HOXB-AS1组的MCF-7细胞侵袭数显著低于Con组和NC组(t=16.093,P=0.000),见图5。

注:A图为Transwell实验;B图为MCF-7侵袭细胞数的统计。

2.4 各组HOXB-AS1对乳腺癌MCF-7细胞凋亡的影响

流式细胞仪检测显示,转染HOXB-AS1后,Con组的MCF-7细胞凋亡率为(93.47±4.72)%、NC组为(90.67±7.37)%、HOXB-AS1组为(31.33±2.59)%,HOXB-AS1组的MCF-7细胞凋亡率显著低于Con组和NC组(t=19.992,P=0.000),见图6,图中Annexin V+/PI+为晚期凋亡细胞或坏死细胞;Annexin V+/PI-为早期凋亡细胞。

注:A图为流式细胞检测;B图为MCF-7细胞凋亡的统计。

2.5 HOXB-AS1对乳腺癌MCF-7细胞的Akt/mTOR介导自噬信号通路的影响

采用Western blot法检测HOXB-AS1对MCF-7细胞的Akt/mTOR信号通路的影响,结果显示,HOXB-AS1组的LC3B显著高于Con组和NC组,HOXB-AS1组的p62显著低于Con组和NC组,HOXB-AS1组的Beclin 1显著高于Con组和NC组,HOXB-AS1组的p-Akt显著低于Con组和NC组,HOXB-AS1组的p-mTOR显著低于Con组和NC组,差异均有统计学意义(P<0.05);HOXB-AS1组的Akt、mTOR与Con组和NC组比较差异均无统计学意义(P>0.05),见表1、图7。

表1 Con组和NC组及HOXB-AS1组Western blot法检测各指标的比较

图7 Western blot法检测HOXB-AS1对MCF-7细胞的Akt/mTOR信号通路的影响

HOXB-AS1降低了p-Akt(Con组为1.49±0.19,HOXB-AS1组为0.89±0.23)、p-mTOR(Con组为1.26±0.12,HOXB-AS1组为0.45±0.19)蛋白的表达,上调了自噬相关蛋白Beclin 1(Con组为0.43±0.11,HOXB-AS1组为1.09±0.22)、LC3B(Con组为1.06±0.18,HOXB-AS1组为1.75±0.16)的表达,下调了自噬相关蛋白p62(Con组为2.06±0.16,HOXB-AS1组为1.68±0.23)的表达,增强了MCF-7细胞的自噬活性。

3 讨论

3.1 HOXB-AS1与乳腺癌的关系

编码转录因子的同源异形盒(homeobox,HOX)基因是生物体内重要的发育调控基因家族。HOX基因高度保守,编码一类转录因子,在胚胎发育中发挥重要调控作用,哺乳动物HOX家族有A、B、C、D亚族,HOXB-AS1为A亚族的一个亚型[7]。研究发现HOXB-AS1在胶质母细胞瘤、子宫内膜癌中表达上调,促进肿瘤细胞的增殖、侵袭和迁移[5-6]。但HOXB-AS1在乳腺癌组织及乳腺癌MCF-7、T-47D细胞中的表达显著下调[4]。HOXB-AS1在乳腺癌发生、发展中的作用目前仍不清楚。

本研究显示,上调HOXB-AS1的表达,乳腺癌MCF-7细胞的活力显著降低,MMP-2、MMP-9的表达水平显著下降,细胞迁移和侵袭数量显著降低。MMP-2和MMP-9可以降解细胞外基质,与细胞的迁移、侵袭相关。此外,流式细胞仪检测结果显示,HOXB-AS1高表达促进了MCF-7细胞的凋亡。这说明HOXB-AS1可抑制乳腺癌MCF-7细胞的增殖、侵袭、迁移及促进凋亡。

3.2 HOXB-AS1与乳腺癌MCF-7细胞自噬的关系

自噬是受损、变性或衰老的蛋白质及细胞器被溶酶体降解的过程。自噬标志物如Beclin 1影响着自噬囊泡的成核过程;LC3B在自噬体的延伸和成熟中发挥着重要作用;p62作为脚手架蛋白将泛素化蛋白运输至自噬体。自噬在乳腺癌的发生发展中发挥着重要作用,Beclin 1是一种肿瘤抑制因子,在乳腺癌中的表达降低,与有丝分裂有关[8]。本研究结果显示,HOXB-AS1促进了Beclin 1的表达。LC3B与自噬小体的数量正相关;p62是一种多聚泛素化蛋白包含LC3B相互作用序列和泛素化结合位点,将泛素化底物和其结合蛋白运输至自噬体降解,因此,自噬过程中p62和LC3B的表达水平呈相反的趋势[9]。转染HOXB-AS1后,LC3B表达水平上调,p62表达下调。这说明HOXB-AS1诱导了乳腺癌MCF-7细胞的自噬。

3.3 Akt/mTOR通路与乳腺癌MCF-7细胞的关系

Akt/mTOR通路在诸多肿瘤中被激活,抑制该通路导致细胞活力降低及促进细胞死亡(包括凋亡和自噬)[10]。本研究显示,HOXB-AS1降低了p-Akt和p-mTOR的表达,抑制了Akt/mTOR通路的活化,诱导了MCF-7细胞发生明显的凋亡和自噬。

综上所述,本研究发现HOXB-AS1通过Akt-mTOR通路介导了MCF-7细胞的凋亡和自噬,抑制其增殖、侵袭、迁移及促进凋亡。LncRNA是MCF-7细胞中信号通路的重要调节因子,包括mRNA的稳定及运输及miRNA的表达[11]。HOXB-AS1如何作用于下游靶点影响MCF-7细胞的死亡仍需进一步的研究探讨。