维生素D辅助低分子肝素治疗复发性流产及对血栓前状态、抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1的影响

张瑞青，刘莉萍，武淑慧

郑州市中医院，1 优生优育/不孕不育科，2 妇科，3 妇产科，郑州 450006

美国生殖医学学会将复发性流产（recurrent spontaneous abortion，RSA）定义为2次或2次以上的妊娠失败；英国皇家妇产科医师协会则定义为与同一性伴侣连续发生3次或3次以上于妊娠24周前胎儿丢失；我国通常将3次或3次以上于妊娠28周前胎儿丢失称为RSA［1-2］。研究显示［3］，RSA的发病机制复杂，约有1/2以上的患者存在血栓前状态（prethrombotic state，PTS）。PTS可导致胎盘微血栓，胎盘血供显著减少，胚胎或胎儿难以正常发育，致使发生RSA。除普遍存在PTS外，RSA的发生还与抗dsDNA抗体、高迁移率族蛋白B1（high mobility group protein B1，HMGB1）、可溶性FMS样酪氨酸激酶1（soluble FMS-like tyrosine kinase 1，sFlt-1）等血清学指标水平异常密切相关［4-5］。对于RSA，既往多给予低分子肝素治疗。尽管低分子肝素可改善RSA患者PTS，但其临床疗效不理想［6］。研究显示［7］，维生素D可增强RSA患者机体对胚胎的免疫耐受，提高妊娠成功率。基于此，本研究在常规治疗基础上联用低分子量肝素钠注射液和维生素D滴剂治疗RSA，评价其临床疗效并探究对血栓前状态、抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1的影响，以期为临床治疗RSA提供参考，现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料

选取2020年10月～2022年10月期间于我院治疗的120例RSA患者作为研究对象，依据随机数字表法分为试验组与对照组，每组60例。本研究经医院伦理委员会审批通过，所有患者及家属均知情同意。

纳入标准：①符合《复发性流产诊治的专家共识》［2］中诊断标准者：妊娠 28周前存在3次或3次以上胎儿丢失，也将连续发生2次自然流产的患者纳入研究。②单胎妊娠者。③年龄23～37岁者。

排除标准：①对本研究药物过敏者。②生殖器官结构异常者。③3个月内使用抗凝、促纤溶及避孕药物者。④男方精液异常或夫妻一方（或双方）染色体异常者。⑤异位妊娠者。⑥合并内分泌、感染疾病者。⑦肝肾功能异常者。⑦其他感染性疾病者。⑧依从性差者。

1.2 研究方法

两组均给予叶酸片（北京斯利安药业有限公司，国药准字H10970079，规格0.4mg）、黄体酮胶囊（浙江仙琚制药股份有限公司，国药准字H20041902，规格50mg）等常规治疗：根据个人孕前补充叶酸情况给予叶酸片1～2片/次，口服，qd；黄体酮胶囊100mg/次，口服，bid。对照组在常规治疗基础上加用低分子量肝素钠注射液（齐鲁制药有限公司，国药准字H20030429，规格：0.4ml∶5000IU）5000IU/次，皮下注射，qd，治疗至孕12周。试验组在对照组基础上口服维生素D滴剂（青岛双鲸药业股份有限公司，国药准字H20113033；规格：每粒含维生素D 400单位）400IU/次，qd，治疗至孕12周。期间密切监测血25羟维生素D［25（OH）D］水平，以避免维生素D中毒。若25（OH）D水平≥60ng/ml，则暂停服用维生素D滴剂；直至其水平降至＜60ng/ml，方可再次给予维生素D滴剂。每4周监测1次血25（OH）D水平。

1.3 观察指标

①观察两组抗体清除及流产、保胎成功率等妊娠结局情况。②分别于治疗前后采集患者清晨空腹静脉血2ml，采用TDZ4K低速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，r=15cm），以3500r/min于25℃离心10min后取血清，保存于-80℃冰箱内待检。采用酶联免疫吸附法检测血清蛋白C（protein C，PC）、蛋白S（protein S，PS）；采用凝血酶凝胶空斑法检测抗凝血酶Ⅲ（antithrombin Ⅲ，AT-Ⅲ）活性，试剂盒购自上海生物制品研究所。③分别于治疗前后采集患者清晨空腹静脉血2ml，采用TDZ4K低速台式离心机（湖南湘仪实验室仪器开发有限公司，r=15cm），以3500r/min于25℃离心10min后取血清，保存于-80℃冰箱内待检。采用酶联免疫吸附法检测血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平，试剂盒购自上海信帆生物科技有限公司。④观察并记录两组患者治疗期间一过性过敏、恶心呕吐、血小板减少、肝功异常等不良反应的发生情况。

1.4 统计学方法

应用SPSS 19.0软件进行数据的分析处理。计量资料以±s表示，行t检验；计数资料以n（%）表示，行χ2检验。检验水准α=0.05；P＜0.05为具有统计学差异。

2 结果

2.1 一般资料

试验组：年龄23～37岁，平均年龄（30.32±3.38）岁；流产次数2～4次，平均流产次数（3.41±0.37）次；孕周5～11周，平均孕周（8.88±0.93）周。对照组：年龄23～37岁，平均年龄（29.91±3.32）岁；流产次数2～4次，平均流产次数（3.36±0.33）次；孕周5～11周，平均孕周（8.81±0.89）周。两组一般资料比较均无统计学差异（P＞0.05），具有可比性（表1）。

表1 两组一般资料比较 n=60，±s

表1 两组一般资料比较 n=60，±s

组别年龄（岁）流产次数（次）孕周（周）试验组30.32±3.383.41±0.378.88±0.93对照组29.91±3.323.36±0.338.81±0.89 t值0.67030.78120.4212 P值0.50400.43630.6744

2.2 抗体清除率及妊娠结局情况

试验组流产率（3.33%）低于对照组（15.00%，P＜0.05）；试验组抗体清除率、保胎成功率均高于对照组（P＜0.05）（表2）。

表2 两组抗体清除率、流产率及保胎成功率比较 n=60，n（%）

2.3 血栓前状态指标

治疗前，两组PC、PS及AT-Ⅲ活性比较均无统计学差异（P＞0.05）。治疗后，两组PC、PS及AT-Ⅲ活性均升高（P＜0.05），且试验组高于对照组（P＜0.05）（表3）。

表3 两组血栓前状态指标比较 n=60，±s，%

表3 两组血栓前状态指标比较 n=60，±s，%

PC：蛋白C；PS：蛋白S；AT-Ⅲ：抗凝血酶Ⅲ；与同组治疗前比较，a：P＜0.05。下同

PC活性PS活性AT-Ⅲ活性治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后试验组52.76±5.6184.77±8.82a48.67±5.13100.65±11.49a75.76±7.91105.83±13.29a对照组53.18±5.6580.55±8.38a49.05±5.1694.74±9.60a76.32±7.9099.54±11.27a χ2值0.40862.68680.40453.05750.38802.7961 P值0.68360.00830.68660.00280.69870.0060组别

2.4 血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平

治疗前，两组血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平比较均无统计学差异（P＞0.05）。治疗后，两组血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平均降低（P＜0.05），且试验组低于对照组（P＜0.05）（表4）。

表4 两组血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平比较 n=60，±s

表4 两组血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平比较 n=60，±s

HMGB1：高迁移率族蛋白B1；sFlt-1：可溶性FMS样酪氨酸激酶1

抗dsDNA抗体（IU/ml）HMGB1（ng/ml）sFlt-1（ng/ml）治疗前治疗后治疗前治疗后治疗前治疗后试验组8.78±0.904.28±0.44a95.15±9.7450.37±5.41a0.68±0.080.47±0.05a对照组8.75±0.884.55±0.48a94.97±9.7253.64±5.68a0.66±0.070.50±0.06a χ2值0.18463.21190.10133.22911.45742.9753 P值0.85380.00170.91950.00160.14770.0036组别

2.5 不良反应发生情况

两组患者治疗期间不良反应发生率比较无统计学差异（P＞0.05）（表5）。

表5 两组不良反应发生率比较 n=60，n（%）

3 讨论

PTS为机体凝血、纤溶及抗凝机制失调或障碍导致的病理状态，是致使发生RSA的重要因素［8］。PTS可使血液高凝，致使胎盘供血不足或微血栓形成，进而导致胚胎难以获得充足的血供而无法正常发育甚至死亡。PTS还可导致血小板继发性增殖，诱导蜕膜发生氧化应激损伤，最终导致RSA［9］。对于存在PTS的RSA患者，临床多行抗凝治疗，以改善血液高凝状态，降低血流阻力，维持胎盘血供［10］。低分子肝素为抗凝药物，可使抗磷脂抗体及其补体失活，抑制血栓形成。低分子肝素可通过影响凝血因子，阻断血小板激活，抑制其聚集，以解除PTS，避免形成局部微血栓，进而改善胎盘血供［11］。低分子肝素可缓解炎症反应过度激活导致的滋养细胞损伤，维持胚胎正常发育。低分子肝素对内源性凝血机制无影响，不会导致内出血，安全性较高。但因低分子肝素治疗RSA难以根治病因，故其临床疗效不理想［12］。维生素D为机体重要的维生素，对于避免发生RSA、维持妊娠正常进行具有重要作用［13］。维生素D可促进巨噬细胞、内皮细胞分泌血栓调节蛋白发挥抗凝作用，以改善PTS［14］。维生素D可通过降低机体同型半胱氨酸水平缓解PTS，避免微血栓形成及胎盘血管损伤，保护胚胎血管及维持胎盘血供，以避免发生RSA［15］。

PC、PS、AT-Ⅲ是反映机体凝血功能的重要指标，其水平低下常预示机体处于高凝状态［16］。PC活化后可通过抑制多种凝血因子发挥抗凝作用，从而阻断凝血进程，避免机体凝血持续进展［17］。PS不但可提高PC活性，增强其抗凝作用，还可结合多种凝血因子抑制其活化，发挥抗凝作用［18］。AT-Ⅲ可结合肝素抑制凝血因子活性，维持机体抗凝与凝血机制间的动态平衡［19］。本研究中，经治疗后，试验组流产率（3.33%）低于对照组（15.00%，P＜0.05）；试验组抗体清除率、保胎成功率均高于对照组（P＜0.05）；两组PC、PS及AT-Ⅲ活性均升高（P＜0.05），且试验组高于对照组（P＜0.05），提示维生素D辅助低分子肝素治疗可抑制RSA的发生，维持妊娠正常进行。

母体免疫紊乱导致无法正确识别胚胎及对胚胎的免疫不耐受是RSA发生的重要因素［20］。抗dsDNA抗体水平大幅升高是自身免疫活性增强的表现。目前，对于抗dsDNA抗体致使RSA发生的机制尚不清晰。部分研究认为［21］，抗dsDNA抗体可能通过异常激活机体免疫，促进免疫复合物于胎盘血管表面沉积，致使胎盘血管损伤。抗dsDNA抗体还可抑制子宫内膜发育，导致胚胎着床及发育障碍，进而导致RSA［22］。HMGB1为DNA结合蛋白，可经细胞分泌或凋亡细胞破裂后释放进入血液，参与机体多种炎症反应。HMGB1可高表达于胎盘组织，诱导Th1/Th2失衡，致使母体免疫异常，引发胚胎免疫排斥［23］。sFlt-1多表达于胎盘滋养细胞，可作用于血管内皮生长因子（vascular endothelial growth factor，VEGF）影响新生血管及子宫内膜形成，进而导致发生流产。机体免疫亢进可促进sFlt-1生成，诱发并促进RSA进展［24］。维生素D可通过抑制B细胞增殖并促进其凋亡，降低抗dsDNA抗体水平，抑制机体免疫亢进，从而缓解机体过度免疫反应［25］。维生素D可通过调控miR-21发挥对调节性T细胞增殖及分化的调节作用，从而抑制机体免疫，改善机体免疫耐受，维持妊娠正常进行［26］。维生素D可增强免疫耐受，在促进Th2细胞增殖的同时，抑制生成Th1细胞，纠正Th1/Th2失衡［27］。维生素D还可参与调控机体炎症反应，抑制炎症因子，提高子宫内膜容受性，有助于胚胎着床及生长［28］。本研究中，两组治疗后血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平均降低（P＜0.05），且试验组低于对照组（P＜0.05），提示维生素D辅助低分子肝素治疗RSA可纠正患者母体免疫紊乱，降低血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平。此外，两组患者治疗期间不良反应发生率比较无统计学差异（P＞0.05），且均较为轻微，提示2种治疗方案均具有较高的安全性。

综上所述，在常规治疗基础上给予维生素D辅助低分子肝素治疗RSA可改善患者血栓前状态，纠正母体免疫紊乱，降低血清抗dsDNA抗体、HMGB1、sFlt-1水平，维持妊娠正常进行，治疗效果理想，且安全性较高。然而，本研究仍存在一定的局限性，如选取的样本较少，且为单中心研究，研究范围较为狭窄，需继续开展大样本、多中心的研究，以获得更为准确的结论，为临床治疗RSA提供依据。