丝氨酸肽酶抑制因子Kazal型5基因多态性与儿童哮喘易感性及病情相关性研究

张 林, 魏 兵, 宋俊美, 刘 宁, 曲双双, 常艳丽

1.辽宁中医药大学,辽宁 沈阳 110847;2.北部战区总医院 新生儿科,辽宁 沈阳 110016

支气管哮喘(以下简称哮喘)是全世界范围内儿童最常见的慢性下呼吸道疾病之一。2010年,我国城市0～14岁儿童哮喘的大规模流行病学调查显示,儿童哮喘累计患病率约为3.02%[1],哮喘会对儿童正常的生长发育及身心健康造成负面影响[2]。哮喘是多基因性的复杂性疾病,了解基因的遗传规律有助于揭示哮喘的致病机制[3]。丝氨酸肽酶抑制因子Kazal型5(serine protease inhibitor Kazal type 5,SPINK5)基因位于人类染色体5q32上,包含33个外显子,全长约61 kb[4]。目前,国内外有关SPINK5基因与哮喘相关性研究较少。本研究旨在探讨SPINK5基因rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位点与哮喘易感性和病情的相关性,为SPINK5基因单核苷酸多态性(single nucleotide polymorphism,SNP)与儿童哮喘的关系提供新的循证医学依据。现报道如下。

1 资料与方法

1.1 一般资料 选取自2020年9月至2022年9月于北部战区总医院就诊的86例哮喘患儿设为哮喘组,其中,男性61例,女性25例;平均年龄(6.87±2.29)岁。纳入标准:(1)符合《儿童支气管哮喘诊断与防治指南(2016年版)》[1]的诊断标准;(2)年龄3～14岁;(3)就诊时存在突然发生的喘息、气促、咳嗽、胸闷等症状或原有症状加重,符合哮喘急性发作的表现。排除标准:(1)合并有自身免疫性疾病、先天性心脏病、肺结核或有恶性肿瘤;(2)肝肾功能不全;(3)正在接受其他研究。再根据哮喘组患儿哮喘的严重程度将其分为轻、中、重度组,轻度组患儿18例,男性10例,女性8例,平均年龄(7.33±2.22)岁;中度组患儿32例,男性22例,女性10例,平均年龄(7.34±2.28)岁;重度组患儿36例,男性29例,女性7例,平均年龄(6.22±2.23)岁。轻、中、重度组患儿的性别比例和年龄比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。另选取同期在该医院体检的66例健康儿童设为健康组,其中,男性33例,女性33例;平均年龄(6.89±2.21)岁。哮喘组与健康组研究对象的年龄及性别比例比较,差异均无统计学意义(P>0.05),具有可比性。本研究经医院伦理委员会批准。所有研究对象家属均签署知情同意书。

1.2 基因位点检测 (1)抽取外周静脉血3 ml于抗凝管中,采用DNA提取试剂盒(上海天昊生物科技有限公司)提取DNA。(2)应用在线Primer 3.0设计PCR引物(表1)。配置PCR反应预混合液:2.0 μl 10×PerfectStart®聚合酶缓冲液(Taq buffer),6.0 μl 10×GC Enhancer,2.4 μl dNTP(2.5 mM),0.8 μl MgCl2(25.0 mM),2.0 μl Probe Mix,0.4 μl 耐热聚合酶(HotStarTaq,2.5 U/μl),5.4 μl 双蒸水(ddH2O)。PCR反应:离心0.5 min,放置PCR仪上进行变性、退火、延伸、保持。(3)在20.0 μl PCR产物中加入5 U 虾碱性磷酸酶和2 U核酸外切酶Ⅰ(Exonuclease Ⅰ),37℃温浴1 h,然后75℃灭活15 min。(4)配置连接反应预混合液:1.0 μl 10×连接酶缓冲液,0.25 μl Labelp Mix,0.4 μl Ligase Primer Mix(1 μM),1.0 μl DNA连接酶(50 U/μl),3.35 μl ddH2O。离心0.5 min,放置PCR仪上,进行变性、连接、保持。(5)连接产物稀释10倍后,取1.0 μl与0.5 μl Liz500 SIZE STANDARD,8.5 μl Hi-Di混匀,95℃变性5 min后上ABI3730XL测序仪。(6)应用软件 GeneMapper 4.1(Applied Biosystems,USA)分析。

表1 PCR引物信息

2 结果

2.1 哮喘组及健康组群体代表性 应用Hardy-Weinberg平衡检验检测健康组和哮喘组的rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706、rs6892205位点的基因型频率,哮喘组P值分别为0.99、0.39、0.99、0.99、0.39,健康组P值分别为0.27、0.34、0.27、0.27、0.30,两组研究样本均符合Hardy-Weinberg平衡定律,提示群体代表性好。

2.2 SPINK5基因5个位点基因型及等位基因在哮喘组及健康组中的分布 健康组和哮喘组SPINK5基因5个位点基因型频率和等位基因频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表2、3。

表2 哮喘组及健康组患儿SPINK5基因5个位点各基因型频率分布情况/例(百分率/%)

表3 哮喘组及健康组患儿SPINK5基因5个位点各等位基因频率分布情况/例(百分率/%)

2.3 SPINK5基因5个位点基因型在轻、中、重度组中的分布 轻、中、重度组SPINK5基因5个位点基因型及等位基因频率比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。见表4、5。

表4 轻、中、重度组患儿SPINK5基因5个位点各基因型频率分布情况/例(百分率/%)

表5 轻、中、重度组患儿SPINK5基因5个位点各等位基因频率分布情况/例(百分率/%)

2.4 连锁分析 经hap-phase软件分析对SPINK5基因5个位点进行连锁不平衡(linkage disequilibrium,LD)分析。红色小方框中数值为LD系数(D′)的百分数,数值越大表示连锁性越强,没有数值表示D′=1,即提示完全连锁不平衡。rs6892205与rs2303067、rs3777134、rs17704908和rs4349706四处位点有强连锁性,同时,rs2303067与rs3777134、rs17704908和rs4349706存在强连锁性。见图1。

图1 LD图

2.5 SPINK5基因5个位点组成单倍型在哮喘组及健康组中的分布 SPINK5基因的5个位点构成6种单倍型,分别为ACCGA、GTTAG、GTTAA、ACCGG、GCCGG和ATTAA,哮喘组和健康组的6种单倍型的频率分布比较,差异均有统计学意义(χ2=8.61,P=0.04);二元Logistic回归结果示单倍型GTTAG罹患哮喘的风险OR值为2.20,95%可信区间1.03～4.70,差异有统计学意义(P<0.05)。哮喘轻、中、重度组的6种单倍型频率分布比较,差异均无统计学意义(P>0.05)。

3 讨论

SPINK5基因编码丝氨酸蛋白酶抑制物,包含15种潜在的丝氨酸蛋白酶抑制区域,是一种非常重要的pH依赖性的表皮脱屑调节器,其在表皮颗粒层分化表达后,转移至角质层与颗粒层的交界处。当SPINK5的mRNA表达水平增加时,可使角质层胰蛋白酶和角质层糜蛋白酶、通道活化丝氨酸蛋白酶1(channel-activating serine protease 1,CAP1)的mRNA表达水平降低[5-7]。角质层胰蛋白酶和角质层糜蛋白酶参与了角层桥粒钙黏素的降解过程,CAP1随着钙离子浓度增加与角质层胰蛋白酶和角质层糜蛋白酶共同作用,释放丝聚合蛋白(filaggrin,FLG),FLG是维持皮肤屏障结构和功能完整的关键蛋白[7]。李令雪等[8]研究表明,FLG基因rs11204981和rs146466242位点携带次要等位基因可能与噬酸性粒细胞百分比和IgE的升高有关。SPINK5基因与上皮细胞的形成及角质形成细胞终末分化过程中蛋白质水解的调节相关,并且该基因的某些突变可导致皮肤屏障功能紊乱[4]。

Walden等[9]研究认为,SPINK5基因中存在与哮喘有关的某些突变。随后,开始陆续有各国学者对SPINK5基因与哮喘的相关性进行研究。Biagini等[10]研究发现,白人儿童群体中SPINK5基因与哮喘的发生显著相关。Martinez-Aguilar等[11]研究结果提示,墨西哥儿童SPINK5基因rs2303067、rs4349706、rs3777134和rs6892205位点基因型和等位基因与儿童哮喘易感性及发病程度均无相关性,但其组成的单倍型与墨西哥儿童哮喘发作具有相关性。Genuneit等[12]分析了13个国家17个研究中心的儿童哮喘人群的结果表明,SPINK5基因与白细胞介素13水平及IgE水平显著相关,在其测试的14个SNP中,有4个与喘息症状相关。本研究对象为中国东北地区汉族儿童,结果表明,SPINK5基因rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位点SNP与儿童哮喘的易感性及病情无相关性,其中,rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位点研究结果与Martinez-Aguilar等[11]研究结果相吻合。

基因连锁不平衡是指同一条染色体上两个等位基因间的非随机相关,其采用连锁不平衡系数D′及相关系数r2进行衡量,LD模式在关联研究的SNP选择中起着重要作用[13]。单倍型是指同一染色体各位点基因紧密连锁组成的基因单。本研究结果表明,SPINK5基因的5位点可构成6种单倍型,其中,GTTAG是儿童罹患哮喘的高危因素,ACCGA、GTTAA、ACCGG、GCCGG和ATTAA与儿童哮喘的易感性及病情无相关性。

综上所述,SPINK5基因rs17704908、rs2303067、rs3777134、rs4349706和rs6892205位点SNP与儿童哮喘的易感性及病情无相关性,其构成的单倍型GTTAG是儿童罹患哮喘的高危因素。但鉴于本研究选择的是中国东北地区汉族儿童,且样本量相对较小,对基因位点检测尚不全面,结果可能受到影响。今后可在加大样本量的同时,进一步进行多中心、多地域、多民族的大规模研究。