基于ORAI1/NFAT 信号轴探讨镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠的作用及机制

陈若曦，姜姗姗，杨洁，杨晓宇，徐蕊瑶，方琳，赵一丁（1. 陕西中医药大学，陕西 咸阳 71046；. 陕西省中医药研究院，陕西西安 710003；3. 陕西省中医医院，陕西西安 710003）

特应性皮炎（Atopic dermatitis，AD）是一种常见的慢性炎症性皮肤病，具有患病率高、病程长、易反复等特点，常伴有个人或家族特应性病史（如哮喘、过敏性鼻炎等）。目前全球约有2%～20%的人群受到AD 的困扰[1]，儿童多于成人。有研究[2]显示，我国城市学龄前儿童罹患皮肤病以湿疹或AD 最为常见，患病率高达18.71%。慢性复发性炎症和瘙痒成为影响AD 患者生活、工作和学习的最重要因素，甚至会合并焦虑、抑郁、失眠等神经系统疾病。在AD的治疗方面，传统的抗组胺药疗效不佳，糖皮质激素、免疫抑制剂、靶向单克隆抗体和小分子拮抗剂虽然能够缓解皮损，但依然未能解决皮损复发及瘙痒等问题[3]。中药复方在治疗AD 方面体现了独特优势，具有抗炎、调节免疫等作用[4]。镇心安神方是根据小儿“心常有余，肝常有余，脾常不足，肾常虚”的生理特点而形成的经验方，组方包括龙骨、牡蛎、骨碎补、淡竹叶及茯苓，具有重镇安神、平肝潜阳、健脾补肾之功效。课题组前期通过多中心随机对照试验[5]证实，镇心安神方能够有效缓解AD 患者的皮损和瘙痒。故本研究拟基于钙通道调节分子1（ORAI1）/T 细胞核因子（NFAT）信号轴探讨镇心安神方对AD小鼠的作用及机制。

1 材料与方法

1.1 动物 36只6～7周龄雌性BALB/c 小鼠，SPF级，体质量16～19 g，由三峡大学实验动物中心提供，实验动物生产许可证号：SCXK（鄂）2017-0012，动物质量合格证号：42010200005530。动物以单笼方式饲养，饲养环境：温度18～24 ℃，自由进食和饮水，昼夜12 h 交替。本动物实验经陕西省中医医院伦理委员会批准，批文号：2018-101。

1.2 药物及试剂 镇心安神方组方：生龙骨30 g、煅牡蛎30 g、骨碎补10 g、茯苓20 g、淡竹叶30 g，配方颗粒由广东一方制药有限公司生产，由陕西省中医医院提供。1-氯-2，4-二硝基苯（1-chloro-2，4-dinitrobenzene，DNCB），日本东京化成工业株式会社，批号：H2UKD-DM；盐酸西替利嗪滴剂，香港澳美制药厂有限公司，批号：HC20070016；一抗钙调磷酸酶A（Calcineurin A，CaN），英国Abcam 公司，批号：Ab282104；一抗ORAI1（批号：DF7956）、NFAT2（批号：DF6446），均购自美国Affinity 公司；白细胞介素4（IL-4，批号：E-EL-M0043c）、白细胞介素13（IL-13，批号：E-EL-M0727c）、胸腺基质淋巴细胞生成素（TSLP，批号：E-EL-M0646c）ELISA试剂盒，均购自武汉伊莱瑞特生物科技公司；BCA蛋白浓度测定试剂盒（批号：P0010）、磷酸酶抑制剂（批号：S1873）、RIPA 裂解液（批号：P0013B），均购自上海碧云天生物技术公司；苯甲基磺酰氟（PMSF），上海阿拉丁生化科技有限公司，批号：P105539；兔多抗GAPDH，杭州贤至生物有限公司，批号：AB-P-R001；HRP 标记羊抗兔二抗，武汉博士德生物工程有限公司，批号：BA1054。

1.3 主要仪器 C2500-R-230V 型高速离心机，美国Labnet 公司；ICV-450 型电热恒温培养箱，日本ASONE 公司；Multiskan MK3 型全自动酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；JT-12J 型生物组织脱水机、JK-6型生物组织摊烤片机，武汉俊杰电子有限公司；2016 型轮转式切片机，德国Leica 公司；DYY-7C 型电泳仪电源、DYCZ-24DN 型垂直电泳槽、DYCZ-40型电转仪，北京六一仪器厂。

1.4 模型复制、分组及给药 小鼠适应性喂养1 周后，参考相关研究[6-7]方法使用DNCB 复制AD 小鼠模型。将36只小鼠以戊巴比妥钠（50 mg·kg-1）腹腔注射麻醉后，用脱毛膏及剃毛刀去除背部毛发，面积约1.5 cm×2.5 cm。然后将小鼠随机分为空白对照组、模型组、西替利嗪组及镇心安神方组，每组9只。除空白对照组外，实验第1、2、3天各组小鼠背部滴涂200 μL 0.5% DNCB 溶液进行致敏；从第4 天起，改用100 μL 1.0% DNCB 溶液涂抹背部脱毛区以维持炎症反应，每周2次，共4周，第28天取材。

实验第14 天开始，各组小鼠以灌胃方式给药，给药组按照人（60 kg）和动物体表面积折算等效剂量。镇心安神方组给予36.36 g·kg-1（按照生药量计算）[7]镇心安神方颗粒水溶液灌胃；西替利嗪组给予1.3 mg·kg-1盐酸西替利嗪滴剂灌胃；模型组及空白对照组均给予10 mL·kg-1生理盐水灌胃；每日1 次，连续给药2周。

1.5 标本采集 采用戊巴比妥钠腹腔注射麻醉小鼠，测定体质量后小鼠摘眼球取血，室温下静置10～20 min 后，以3 500 r·min-1（离心半径=8.479 cm）离心10 min，收集上清液，速冻保存以备ELISA 检测。剪取小鼠背部致敏区皮肤；一部分置于10%中性甲醛溶液中固定24 h，用于组织病理学检测；另一部分用液氮速冻，-80 ℃保存。摘取小鼠脾脏组织，吸干水分，测定脾脏质量，计算：脾脏指数（mg·g-1）=脾脏质量（mg）/小鼠体质量（g）。

1.6 皮损评分 参考相关研究[7-8]测定皮损面积，并对皮损严重程度进行评分。根据皮损处红斑、丘疹、渗出、结痂、干燥等严重程度进行打分：0 分为无皮损，1分为轻度，2分为中度，3分为重度。评分越高表示AD皮损越严重。

1.7 皮损组织病理学观察 取10%中性甲醛溶液固定后的小鼠皮肤组织，经脱水、石蜡包埋、切片、HE染色后，在光学显微镜下观察皮损组织病理变化，并测量各组小鼠皮损组织的表皮层及真皮层厚度。

1.8 ELISA 法检测血清中IL-4、IL-13 及TSLP 的含量 取“1.5”项下冻存的小鼠血清，与试剂平衡至室温，严格按照试剂盒说明书步骤操作，检测血清炎症因子IL-4、IL-13及TSLP的含量。

1.9 Western Blot 法检测皮损组织中ORAI1、CaN、NFAT2 蛋白表达水平 取“1.5”项下冻存的小鼠皮肤组织30 mg，提取并采用BCA 法测定总蛋白浓度。采用SDS-PAGE 凝胶电泳分离蛋白，并转印至PVDF膜上；用含5%脱脂奶粉的TBST 在室温下摇床封闭2 h后，加入一抗ORAI1、CaN、NFAT2、GAPDH（均为1∶1 000），4 ℃下孵育过夜；TBST充分洗膜5～6次后，加入HRP 标记的羊抗兔二抗（1∶10 000），37 ℃摇床孵育2 h；TBST 洗膜3 次，采用ECL 化学发光法曝光显影，拍照；采用BandScan 软件分析蛋白条带灰度值，以GAPDH 为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.10 统计学处理方法 采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD 检验，不符合正态分布或方差齐性的资料采用非参数秩和检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 镇心安神方对AD 小鼠皮损评分及皮损面积的影响 结果见图1、表1。除空白对照组外，其他各组小鼠在涂抹DNCB 后，背部皮肤出现红斑、丘疹等急性炎症反应，继而出现渗出、结痂，痂皮逐渐干燥、脱落，伴轻微鳞屑及苔藓样变。与空白对照组比较，模型组小鼠的皮损评分显著升高（P＜0.01），皮损面积显著扩大（P＜0.01）。与模型组比较，镇心安神方组小鼠的皮损评分显著降低（P＜0.01），皮损面积显著缩小（P＜0.01）。结果表明，镇心安神方能够明显改善DNCB诱导AD小鼠的皮损症状。

表1 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损评分及皮损面积的影响（±s，n=9）Table 1 Effects of Zhenxin Anshen Prescription on skin lesion scores and skin lesion area of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

表1 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损评分及皮损面积的影响（±s，n=9）Table 1 Effects of Zhenxin Anshen Prescription on skin lesion scores and skin lesion area of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别空白对照组模型组西替利嗪组镇心安神方组剂量/（g·kg-1）--1.3 mg·kg-1 36.36皮损评分/分0 10.11±1.27**5.00±1.32##3.88±0.93##皮损面积/cm2 0 3.52±0.27**3.19±0.33#2.89±0.35##

图1 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损情况的影响Figure 1 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on skin lesion of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene

2.2 镇心安神方对AD 小鼠皮损组织病理形态变化的影响 结果见表2、图2。与空白对照组比较，模型组小鼠表皮层及真皮层厚度显著增加（P＜0.01），表皮过度角化，棘层肥厚，真皮层可见嗜酸性粒细胞、淋巴细胞等炎性细胞浸润。与模型组比较，镇心安神方组小鼠表皮层及真皮层厚度显著降低（P＜0.01），表皮过度角化减轻，棘层轻度肥厚，真皮层有少量炎性细胞浸润。结果表明，镇心安神方可显著改善AD 小鼠的皮肤病理损伤，降低炎性细胞浸润水平。

表2 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损组织厚度的影响（±s，n=3）Table 2 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the thickness of skin lesions tissue in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=3）

表2 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损组织厚度的影响（±s，n=3）Table 2 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the thickness of skin lesions tissue in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=3）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别空白对照组模型组西替利嗪组镇心安神方组剂量/（g·kg-1）--1.3 mg·kg-1 36.36表皮层厚度/μm 20.17±1.70 75.27±7.20**44.20±3.72##32.40±5.31##真皮层厚度/μm 139.53±17.00 263.03±27.58**206.93±17.57##188.93±13.56##

图2 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损组织病理变化的影响（HE 染色，×400）Figure 2 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on pathological changes of skin lesions tissue in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（HE staining，×400）

2.3 镇心安神方对AD 小鼠脾脏指数的影响 结果见表3。与空白对照组比较，模型组小鼠的脾脏指数显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，镇心安神方组小鼠的脾脏指数显著降低（P＜0.01）。结果表明，镇心安神方对AD小鼠具有一定的免疫调节作用。

表3 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠脾脏指数的影响（±s，n=9）Table 3 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the spleen index of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

表3 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠脾脏指数的影响（±s，n=9）Table 3 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on the spleen index of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别空白对照组模型组西替利嗪组镇心安神方组剂量/（g·kg-1）--1.3 mg·kg-1 36.36脾脏指数/（mg·g-1）0.53±0.01 0.85±0.10**0.73±0.02##0.69±0.03##

2.4 镇心安神方对AD 小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP水平的影响 结果见表4。与空白对照组比较，模型组小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，镇心安神方组小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平显著降低（P＜0.01）。结果表明，镇心安神方对AD小鼠具有一定的抗炎作用。

表4 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平的影响（±s，n=9）Table 4 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on serum IL-4，IL-13 and TSLP levels in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

表4 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠血清IL-4、IL-13、TSLP 水平的影响（±s，n=9）Table 4 Effect of Zhenxin Anshen Prescription on serum IL-4，IL-13 and TSLP levels in atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=9）

注：与空白对照组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别空白对照组模型组西替利嗪组镇心安神方组剂量/（g·kg-1）--1.3mg·kg-1 36.36 IL-4/（pg·mL-1）78.89±11.38 255.80±10.35**118.13±8.96##132.60±10.74##IL-13/（pg·mL-1）49.72±13.68 278.77±28.51**141.11±22.94##144.05±21.43##TSLP/（pg·mL-1）46.25±9.50 166.16±13.86**72.83±11.30##79.26±9.83##

2.5 镇心安神方对AD 小鼠皮损组织中CaN、NFAT2、ORAI1 蛋白表达水平的影响 结果见图3。与空白对照组比较，模型组小鼠皮损组织中CaN、NFAT2、ORAI1 蛋白表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，镇心安神方组小鼠皮损组织中CaN、NFAT2、ORAI1蛋白表达水平显著降低（P＜0.01）。

图3 镇心安神方对1-氯-2，4-二硝基苯诱导特应性皮炎小鼠皮损组织中CaN、NFAT2、ORAI1 蛋白表达水平的影响（±s，n=3）Figure 3 Effects of Zhenxin Anshen Prescription on protein expression levels of CaN，NFAT2 and ORAI1 in skin lesions of atopic dermatitis mice induced by 1-chloro-2，4-dinitrobenzene（±s，n=3）

3 讨论

特应性皮炎（AD）无论有无皮损、急性期或慢性期，Th2 型炎症反应贯穿了其发病的全过程。AD 导致皮肤屏障破坏后，过敏原、细菌、尘螨及机械损伤均可激活角质形成细胞（Keratinocytes，KC），活化的KC能够大量表达TSLP[9]。TSLP是一种类IL-7细胞因子，在皮肤、气道和眼、鼻上皮及黏膜下层等部位广泛表达，目前普遍认为TSLP在AD、哮喘、过敏性鼻炎等疾病中发挥“开关”作用，能够启动Th2型炎症反应。在AD 患者及AD 动物模型中，皮肤或血清中的TSLP 表达水平明显升高，且与症状及严重程度呈正相关[10]。近年来有研究[11]发现，KC 中的TSLP过表达会引发小鼠强烈抓挠及出现湿疹样皮损，而在缺乏T 细胞、B 细胞或肥大细胞（Mast cell，MC）的转基因小鼠中，TSLP依然可以介导瘙痒信号的传递，说明TSLP 诱发的神经激活可以脱离免疫招募。这是由于在触发Th2 型免疫反应的同时，TSLP 可直接作用于皮肤感觉神经元，通过激活皮肤中瞬时受体电位锚蛋白1（Transient receptor potential ankyrin 1，TRPA1）传递瘙痒信号[12]。

KC 中TSLP 信号通路的活化受ORAI1/NFAT 信号轴的调控。由于屏障破坏后各种内、外源性蛋白酶进入表皮，触发内质网Ca2+释放、耗尽。随着细胞内钙库排空，ORAI1 定位于KC 细胞膜上，并且呈弥散分布，当内质网钙库释放时，ORAI1 随之出现重排，启动钙库操纵性钙内流（Store operated calcium entry，SOCE），使Ca2+流入KC[13]。Ca2+浓度升高可触发CaN去磷酸化及NFAT 的核转位，NFAT 可诱导TSLP 的转录[14]。TSLP 通过与树突状细胞（Dendritic cells，DC）表面的TSLP 受体识别并诱导DC 成熟，促进CD4+T细胞前体向Th2 细胞分化。活化的Th2 细胞和Th2 型固有淋巴细胞（Type2 innate lymphoid cells，ILC2）能分泌大量IL-4、IL-5、IL-13、IL-31 等炎症因子，诱导B 细胞产生抗原特异性IgE 分子，促进嗜酸性粒细胞的成熟和募集[15]，增强肥大细胞对过敏原的识别，产生大量细胞因子和生物活性物质，从而引起免疫级联反应。而IL-4、IL-13 等炎症因子过表达可以诱导KC 下调表皮屏障蛋白的分泌，加剧皮肤屏障的破坏[16]。

AD好发于儿童，明代医家万全指出：“五脏之中肝有余，脾常不足，肾常虚，心热为火同肝论，娇肺遭伤不易愈”，明确了小儿“心常有余，肝常有余，脾常不足，肺常不足，肾常虚”的生理特点[17]。心主神明，而小儿始生，神识未全，多情绪不稳，易喜易怒、易惊易动，故心神易动，心火易亢。小儿生机蓬勃，发育迅速，恰应肝木少阳升发之气，心肝火旺，君相二火妄动，内扰心神，引动肝风，风盛则痒，表现为心神不定，情绪不稳，烦躁难寐，瘙痒难耐。有研究[18]发现，心火亢盛型AD 患者体内的Th2型细胞因子表达高于其他证型，存在免疫失衡和神经系统激活，说明“心肝有余”与AD 发病的神经免疫网络密切相关。小儿为纯阳之体，生机旺盛，发育迅速，需要的水谷精微物质相对较多，脾胃成而未全，全而未壮，加之饮食不当，故常呈现脾虚之证。有研究[19]发现，应用健脾中药治疗AD 可以显著改善患者的临床症状。小儿甫生，先天之精因生长发育迅速而不断被消耗，故肾常虚。先天父母之精气所承载的即为遗传信息，现代医学已证实AD 具有一定的遗传易感性。本研究中，镇心安神方重用龙骨、牡蛎重镇安神，平肝熄风，佐以淡竹叶清心除烦，针对“心肝有余”之病机；骨碎补配伍茯苓健脾补肾，针对“脾肾不足”之病机，共同发挥治疗AD的作用。

综上所述，镇心安神方能够改善DNCB 诱导AD小鼠的皮肤病理损伤，可能与其抑制ORAI1、CaN 及NFAT2 蛋白表达，降低血清TSLP、IL-4、IL-13 等2 型炎症因子水平，通过免疫调节改善皮肤炎症及瘙痒有关。