基于数据挖掘和网络药理学探讨杨丽新治疗抽动障碍用药规律和作用机制

胡彬文，段然，张潞璐，余婉儿（1. 广东省中医院吕英名医工作室，广东广州 510120；2. 广东省中医院儿科，广东广州 510120；3.广州黄埔区萝岗街社区卫生服务中心，广东广州 510700；. 广州中医药大学，广东广州 51005）

抽动障碍（Tic disorders，TD）是一种神经精神发育障碍性疾病，主要发生在儿童和青少年，临床表现以无节律、多发、刻板的运动性抽动和发声性抽动为特征。抽动障碍常伴有注意力缺陷多动障碍（Attention deficit and hyperactivity disorder，ADHD）、学习困难（Learning difficulties）等疾病，对患儿的学习、社交和心理健康产生了严重影响[1]。目前对于抽动障碍的治疗，西药治疗具有一定的局限性和副作用[2]。

在中医药方面，虽然无明确记载抽动障碍的病名，但根据其临床表现，中医学者将本病归于肝风证、慢惊风、瘛疭等范畴。杨丽新教授从事小儿神经系统疾病诊疗30 余年，有丰富的临床经验，师从罗笑容教授并继承了肝脾两脏辨治的学术观点[3]，灵活运用“补脾平肝泻心”六字诀治疗抽动障碍[4]，认为抽动障碍病位在肝，与心脾肾相关，其标为风痰，脏腑失调，虚实并见，提出本病病机为“脾虚肝旺，风痰内扰”。

本研究搜集杨丽新教授2016 年于广东省中医院儿科门诊治疗抽动障碍的门诊医案，运用“中医传承辅助平台（V2.5）”分析总结杨丽新教授治疗抽动障碍的用药规律，并根据分析结果进行网络药理学分析，以探索其治疗抽动障碍处方中核心药物的药物靶点及可能作用机制，以期更好地指导该病的临床实践。

1 材料与方法

1.1 临床医案数据挖掘研究

1.1.2 纳入标准 抽动障碍西医诊断标准符合《儿童抽动障碍诊断与治疗专家共识（2017 实用版）》[5]标准。中医诊断标准参考《中医诊断学》[6]《中医儿科学》[7]。符合以上中西医诊断的患儿；病案信息完整；复诊时患儿抽动情况有改善，和/或相关症状减轻或消失者，同时符合上述3项者，为纳入病例。

1.1.3 排除标准 不符合以上纳入标准者；患儿经检查有其他系统的严重疾病；患有其他儿童行为障碍疾病或精神类疾病者。

1.1.4 处方录入与核对 对中西医诊断进行统一命名，如“儿童抽动障碍”“小儿抽动症”“抽动症”“TS”和“抽动秽语综合征”都统一为“抽动障碍”；规范处方用药，根据《中华人民共和国药典》[8]对处方药物合并、修改。将全部病案资料导入“中医传承辅助平台（V2.5）”，通过“临床采集”录入患儿的基本信息和中药处方，并且双人核对，保证资料的正确性。

1.1.5 数据分析 使用“中医传承辅助平台（V2.5）”进行数据管理和挖掘，对处方中药使用频数、性味归经、功效分类进行统计分析。运用关联规则进行组方分析，基于K-means 算法进行聚类得到核心组合方。

1.2 网络药理学研究

1.2.1 核心中药处方靶点与抽动障碍疾病靶点筛选将处方分析中的高频药物在TCMSP（https：//tcmsp-e.com/）、ETCM（http：//www.tcmip.cn/ETCM/）、TCMID（https：//www.megabionet.org/tcmid/）、Batman（http：//bionet.ncpsb.org/batman-tcm/）数据库中检索，得到的中药成分在TCMSP 数据库中进行筛选，以药物口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%，药物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18 作为条件筛选活性成分，同时结合已发表的文献报道对筛选后的成分进行补充。在TCMSP 数据库进行活性成分靶点蛋白的预测，在Uniprot 数据库（h-ttps：//www.uniprot.org/）查询所对应的基因名称，剔除非人类的靶点基因。在Genecard 数据库（https：//www.genecards.org）、Drugbank 数据库（https：//go.drugbank.com/）及TTD 数据库（http：//db.idrblab.net/ttd/）中以“Tic Disorders”为关键词检索疾病靶点。

Some Ideas on the Development Mode of Smart Grid TONG Guangyi,WANG Mengzhen,DU Songhuai,HU Bo,SU Juan(21)

1.2.2 “药物-活性成分-靶点”网络图构建及蛋白相互作用分析 在Venny 2.1.0（https：//bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html）中导入获得的疾病靶点与药物靶点，生成韦恩图，得到交集靶点。使用Cytoscape 3.7.2 软件构建“药物-有效成分靶点”关系网络。利用STRING 数据库（https：//string-db.org），限制为“homo sapiens”后，在线分析蛋白之间的互相作用，设置最高置信度评分＞0.40。使用Cytoscape软件，将互作网络的信息导入其中，再利用bisogenet插件计算网络，根据度值（degree）、介度中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）等条件，对靶点进行中位数过滤，来选取核心网络。

1.2.3 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 采用Metascape 在线数据库（https：//metascape.org/）对获得的关键靶点进行靶点基因GO 功能及KEGG 通路富集分析，分别获得相应的富集分析结果（P＜0.05），最后利用R语言进行可视化绘图。

1.3 分子对接分析 通过PubChem 数据库（https：//pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/）获取核心药物主要有效成分的SDF 格式文件，在PDB 数据库（http：//www.rcsb.org/）收集关键靶点蛋白结构，使用PyMOL 软件对靶点进行清除水分子和小分子配体等优化处理并用AutoDock Tools 进行加氢与电荷处理并另存为pdbqt格式。以关键靶点为受体，以其对应的有效成分作为配体，利用Pyrx软件内部的vina进行分子对接，计算结合能及输出结果文件。最终利用PyMOL 软件进行结果可视化处理。其Affinity（kcal·mol-1）值即代表两者结合的结合能力，结合能力越低，配体与受体结合越稳定。使用PyMOL（https：//pymol.org/2/）对其行可视化分析。

2 结果

2.1 病案数据挖掘研究

2.1.1 药物出现频数及药效分类 共录入3 443 个病例，涉及77 味中药，使用频率不低于50%的共10 味药，详见表1。参考《中药学》[9]，按照功效对药物进行归类和统计，结果发现解表类药物出现频数最多，共8 874 次；其次为平肝熄风类药物，出现了8 648次，药效分类见图1。

图1 杨丽新治疗抽动障碍中药的药效分类分析Figure 1 Drug eifficacy analysis of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

表1 杨丽新治疗抽动障碍中药的频数分析Table 1 Drug frequency analysis of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.1.2 药物的性味归经统计 经过统计分析，发现77 味中药的性味以寒温、辛甘苦为主，多归肺、脾、肝、胃四经，详见图2。

图2 杨丽新治疗抽动障碍药物的性味归经分析图（频数/次）Figure 2 Analysis of drug nature， flavour and meridians of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders（frequence/times）

2.1.3 基于关联规则的组方规律分析 在“关联规则”分析中，设置支持度80%、置信度为90%，分析得到6 味核心中药（竹茹、法半夏、陈皮、牡蛎、茯苓、甘草），共32条药物组合。按核心药物组合置信度由高到低排序，常用药对组合见表2。6 味核心药物的关系见图3。

图3 杨丽新治疗抽动障碍核心药物关系的网络可视化分析Figure 3 Visualization analysis of relationship network for core TCM of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

表2 杨丽新治疗抽动障碍常用的核心药物组合关联规则Table 2 Correlation rules of core drugs combinations and correlation rules of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.1.4 核心组合统计分析 见表3，利用“聚类分析”功能（k-means 算法与回归模型相结合），将“聚类”列为4，得到4 组核心组合。反映了杨丽新教授治疗抽动障碍处方中配伍关系相对密切、固定的4 组药物，即核心组方。

表3 基于聚类分析的杨丽新治疗抽动障碍的核心组合Table 3 Core drugs formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2 基于网络药理学研究核心药物治疗抽动障碍的机制

2.2.1 筛选核心中药成分与作用靶点 基于中药频数分析，陈皮、甘草、法半夏、竹茹、茯苓、牡蛎及钩藤为使用频次＞75%的高频药物，故选这7种药物作为杨丽新教授治疗抽动障碍的核心组方进行分析。通过TCMSP 数据库筛选及文献补充[10-11]，去重后得到核心药物的活性成分145 个，其中共有成分4 个。对活性成分靶点进行检索，将数据规范化及去重后得到220 个靶点。活性成分以拼音首字母+数字编号，共有成分编号为A、B、C、D，导入Cytoscape 3.7.2软件中，构建药物-活性成分-靶点的网络图，详见图4。网络共包含373 个节点（含145 个活性成分、220 个靶点基因），2 691 条边。由于活性成分较多，筛选度值排序前10 位的活性成分进行展示，详见表4。

图4 杨丽新治疗抽动障碍核心组方药物的“药物-活性成分-靶点”网络图Figure 4 Network diagram of “medicinals-active ingredients-targets” for core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

表4 杨丽新治疗抽动障碍核心组方的活性成分Table 4 Active ingredients of core drugs formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2.2 核心处方治疗抽动障碍的作用靶点 基于Genecard、TTD 及Drugbank 数据库筛选抽动障碍相关靶标分别有77、5 及1 220 个，经过除重后得到1 290个疾病靶点。将1 290个疾病靶点及220个成分靶点导入Venny 2.1.0 中，取得共同靶点58 个，绘制韦恩图，详见图5。

图5 杨丽新治疗抽动障碍核心组方药物靶点与抽动障碍疾病靶点共有靶点的韦恩图Figure 5 Venn diagram of common targets between target of tic disorders and drug target of core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2.3 蛋白互作网络分析 将靶点信息导入STRING在线数据库，置信度评分＞0.40，隐藏游离节点，得到核心处方治疗抽动障碍的对应的靶标PPI（Protein-Protein Interaction，PPI）网络，将其导入Cytoscape 软件做可视化处理。靶点越接近中心、颜色越红则靶点相互作用度越高，结果见图6。运用Cytoscape 的bisogenet 做疾病和药物的PPI 网络，根据度值、介度中心性、接近中心性、特征向量中心性来选取核心网络，详见图7。

图6 杨丽新治疗抽动障碍核心组方的蛋白质互相作用网络图Figure 6 Protein interaction network diagram of core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

图7 杨丽新治疗抽动障碍核心组方的核心靶点网络Figure 7 Core targets network of core formula of Professor YANG Lixin’s treatment on tic disorders

2.2.4 GO 功能富集分析及KEGG 通路富集分析 运用Metascape 数据库对58 个共同靶点进行GO 功能及KEGG 通路富集分析。得到GO 功能富集条目422 条，其中生物过程（BP）304条，主要包括多细胞系统调节通路、对有机氮化合物的反应通路及膜电位调节通路等。细胞组成（CC）44 条，包括突触、离子通道复合物及树突等。分子功能（MF）74 条，包括G 蛋白偶联胺受体、神经递质受体活性及门控通道活性等。生物功能186 条。根据GO 富集结果，应用R 语言对前20 位绘图，见图8。筛选得到KEGG 通路68 条，取前20 位应用R 语言绘制KEGG 气泡图，见图9。得到神经活性配体-受体相互作用、血清素的神经突触、cGMP-PKG等关键信号通路。

图8 杨丽新核心组方治疗抽动障碍的GO 功能富集分析Figure 8 GO analysis of Professor YANG Lixin’s core formula for the treatment of tic disorders

图9 杨丽新核心组方治疗抽动障碍的KEGG 功能富集分析Figure 9 KEGG analysis of Professor YANG Lixin’s core formula for the treatment of tic disorders

2.3 分子对接分析 选取表4 中度值最高的4 个活性成分与图6 中前4 个核心靶点，进行分子对接。成分与靶点的结合能见表5，研究[12]认为，对接能量值小于-4.25 kcal·mol-1表示两者间有一定的结合活性，小于-5.0 kcal·mol-1表示有较好的结合活性，小于-7.0 kcal·mol-1表示有强烈的结合活性。结果显示，各靶点与活性成分的对接结合能均小于-5.0 kcal·mol-1，说明受体蛋白与配体小分子之间具有较好的结合活性，其中刺芒柄花素与HTR2A，β-豆甾醇与HTR2C，山柰酚与SCL6A4、HTR2A 有非常强的结合活性。PyMOL中进行可视化分析，结果见图10。

图10 核心靶点与成分分子对接模式图Figure 10 Molecular docking pattern diagram between core targets and molecules of active ingredients

表5 分子对接结合能分析（kcal·mol-1）Table 5 The analysis of binding energy of molecular docking（kcal·mol-1）

3 讨论

3.1 用药规律 抽动障碍症状及共患病对部分患儿生活造成困扰，治疗上存在依从性较差和药物不良反应的问题。中医药治疗抽动障碍临床疗效显著，杨丽新教授经过多年临床实践，在治疗儿童抽动障碍上形成了一套独特的理论体系，本研究通过数据挖掘及网络药理学研究归纳杨丽新教授的用药规律及可能的作用机制。

本研究结果显示，杨丽新教授治疗抽动障碍用药药性以寒温并用，药味以辛、甘、苦味最多。寒药清热平肝，温药温化痰邪、温通经络，又能以温宣温散之法祛除肝风，同时制约寒性药物，顾护脾胃。《素问·脏气法时论》中指出：“肝苦急，急食甘以缓之”“肝欲散，急食辛以散之，用辛补之，酸泻之”“脾欲缓，急食甘以缓之，用苦泻之，甘补之”，以辛开甘补为主，辛开苦降为辅，共奏调肝理脾之功。

杨丽新教授用药多归肺、脾经，肝、胃经次之，解表与平肝熄风药物使用频率高达8 000 次。《杂病源流犀烛》曰：“风邪袭人，不论何处感受，必内归于肺。”《素问·至真要大论》曰：“诸风掉眩，皆属于肝”。小儿肺、脾常不足，肝常有余，肺卫不固，风邪趁虚入里，脾虚不运则痰湿停滞，外风引动内风，风痰流窜，造成抽动反复发作，因此应平肝熄风同时兼顾肺脾，宜用宣肺解表与健脾补肺药物，提高抗御外邪的能力，日常让患儿加强调护，增强体质。脾胃互为表里，胃强脾弱则中焦气机升降失常，气滞则肝郁，故运脾必当和胃。杨丽新教授治疗抽动障碍使用辛、甘、苦、平之品，寒温并调，通过调肺、健脾和胃、疏肝平肝、化痰的方法，恢复脏腑的正常生理功能，从而达到抽动自止的目的。

使用频次＞75%的药物有陈皮（97.30%）、甘草（96.72%）、法半夏（94.25%）、竹茹（94.19%）、茯苓（89.75%）、牡蛎（85.94%）、钩藤（79.70%），通过关联规则分析共获得32 组常用药物组合，聚类分析共得到4 组核心组合，其中“甘草-法半夏-竹茹-陈皮-茯苓-僵蚕”出现频率最高，综合结果得出核心组方为二陈汤，其中：法半夏、陈皮燥湿化痰，二者皆以陈久者良，无过燥之弊，并结合茯苓的健脾渗湿，杜生痰之源，甘草调和诸药又益气补中，加竹茹的清热化痰、除烦，可用于治疗胆火挟痰、惊悸不宁[13]等症状。钩藤有平肝熄风之功效，《药性论》曰：“主小儿惊啼，瘈疭热壅”。王向明等[14]从钩藤提取钩藤碱，发现钩藤碱组大鼠脑中多巴胺含量显著高于模型对照组，提示钩藤碱具有调节脑内多巴胺表达的作用。牡蛎味咸涩，归肝肾经，具有镇静安神、平肝潜阳的功效，主要化学成分为钙盐，含有多种微量元素，具有抗惊厥的药理作用[15]。以上组合体现了杨丽新教授“补脾平肝泻心”的六字思想。

3.2 作用机制 将杨丽新教授治疗抽动障碍的高频药物进行网络药理学研究，其中的关键成分包括：山柰酚、7-甲氧基-2-甲基异黄酮、刺芒柄花素、β-豆甾醇与黄芩素等。山柰酚（Kaempferol，KAE），又名山柰素、山柰黄酮醇，是一种多羟基黄酮类化合物，广泛存在于各种蔬菜及水果中。山柰酚对神经系统有保护作用，包括抗炎、抗氧化、抗惊厥、抗抑郁、抗痴呆，以及对缺血脑组织的保护作用等[16]。抽动障碍患儿存在抑制性氨基酸及兴奋性氨基酸失衡的情况[17]。山柰酚可以有效降低谷氨酸含量，降低氧化应激作用[18]。刺芒柄花素（Formononetin，FMN）是一种异黄酮类化合物，研究发现[19]FMN可以抑制星形胶质细胞、神经元和小胶质细胞中COX-2 的活性，有效降低颅内炎症介质含量，如肿瘤坏死因子（TNF）-α和IL-6。β-豆甾醇[19]是一种植物甾醇，实验证明β-豆甾醇可通过增加过氧化氢酶、超氧化物歧化酶和谷胱甘肽的活性，提高体内抗氧化酶活性的能力，改善金属中毒后小鼠认知能力、运动协调性及减少大脑损伤[20]。

为了探索有效药物活性成分治疗抽动障碍的作用机制，构建了活性成分与疾病的网络PPI图，筛选出核心作用靶点后进行KEGG 通路和GO 功能富集分析。核心成分的靶标主要与神经递质的转运以及活性相关。目前主要认为抽动障碍的产生与神经生化、遗传、免疫等因素相关，从神经生化的角度分析，相关研究发现抽动障碍与多巴胺（Dopamine，DA）、5-羟色胺（5-hydroxytryptamine，5-HT）、肾上腺素（Noradrenaline，NE）等神经递质的水平失调有关，尤其与大脑DA 水平关系密切[21]。SLC6A3编码多巴胺转运蛋白，在突触间的多巴胺浓度调节中发挥重要作用[22]。SLC6A4 编码的5-羟色胺转运体可以从突触或细胞外空间重新摄取5-HT，从而调节大脑中的5-HT活动[23]。HTR2A 编码5-羟色胺受体2A，其表达增高可引起大脑内5-HT的表达水平下降[24]。

核心靶点的主要信号通路也与体内神经递质的调节密切相关。神经活性配体受体相互作用信号通路（Neuroactive ligand- receptor interaction）与调控人体学习、认知、焦虑情绪等相关，通过调节细胞内受体结合相关基因表达[25]，对神经递质调节、心理、行为等产生影响，从而对抽动障碍发挥治疗作用。研究[26]表明部分抽动障碍患者在链球菌感染后出现症状加重，cGHP-PKG 具有调节蛋白磷酸酶、细胞内钙离子水平以及神经递质的功能，其中蛋白磷酸酶参与免疫信号转导的功效。cGMP 信号传导功能障碍与记忆障碍密切相关，细胞内钙离子水平影响神经肌肉兴奋性，同时也参与神经递质释放及激素调节等过程，考虑该通路可能通过影响体内免疫传导、记忆认知以及神经-体液调节等过程影响患儿的行为和认知[27]。有研究发现抽动障碍患者基底节区5-HT 的含量下降[28]，而给予对5-HT 受体有高亲和力的新一代抗精神病药物利培酮，可有效治疗患有情绪障碍的抽动障碍患儿[29-30]，提示核心成分可能通过作用于血清素能突触通路（Serotonergic synapse pathway），调节5-HT 含量，对疾病起到一定的治疗作用。分子对接结果进一步证明，组方核心成分与相关疾病靶点之间有良好的结合活性，核心组方可能通过山柰酚、刺芒柄花素、β-豆甾醇作用于SCL6A4、HTR2C、HTR2A等靶点对儿童抽动障碍起治疗作用。

4 小结

通过对杨丽新教授门诊病历处方进行的数据挖掘及网络药理学分析，结果表明杨丽新教授治疗抽动障碍重在平肝熄风，健脾化痰，兼顾肺脏，常采用温胆汤结合临床辨证化裁，用药配伍寒温并用，固护脾胃，提倡“补脾平肝泻心”。网络药理学研究得出的核心组方可能通过山柰酚、刺芒柄花素、β-豆甾醇等活性成分作用于相关信号通路，调节大脑DA、5-HT等神经递质水平来治疗儿童抽动障碍。