萸连丸对葡聚糖硫酸钠诱导的溃疡性结肠炎小鼠记忆性滤泡辅助性T 细胞的调节作用

周文，张哲言，黄莉，邓柏龄，刘端勇，陈文潇，赵海梅（.南昌医学院/江西省卫生健康药效与安全性评价重点实验室，江西南昌 005；.江西中医药大学研究生院，江西南昌 000；.江西中医药大学中医学院，江西南昌 000；.江西中医药大学方证研究中心，江西南昌 000）

溃疡性结肠炎（Ulcerative colitis，UC）是一种病因和发病机制尚不完全清楚的慢性非特异性直结肠炎症性肠病（Inflammatory bowel disease，IBD）。IBD在我国的发病率和流行率逐年攀升，因其病因复杂多样、病程迁延漫长、复发率高且病变程度差异大[1]，已成为难治性消化系统疾病之一[2]。滤泡辅助性T 细胞（Follicular T helper cell，Tfh）可以帮助B 细胞产生有效和持久的免疫应答以对抗抗原的侵袭，在免疫反应中起关键作用；Tfh 细胞功能异常时，可导致在清除外来抗原的同时诱导自身反应性抗体的产生，从而引发抗体介导的自身免疫性疾病[3]。大多数学者认为Tfh 细胞介导的免疫功能失调与炎症性肠病的发生发展密切相关[4]，而记忆性滤泡辅助性T 细胞（Memory follicular T helper cell，mTfh）与Tfh 细胞相似，在体内通过同源抗原的再刺激后协助记忆B细胞快速增殖并分化为浆细胞[5]，因此推测mTfh细胞失衡与溃疡性结肠炎的发生发展相关。

萸连丸出自《百一选方》卷六，名见于《证治要诀类方》卷四，由黄连和吴茱萸按1∶1 组成。黄连清热燥湿、解毒泻火，吴茱萸散寒止痛、降逆止呕，两者寒热并用、辛开苦降，主治泻泄和痢疾。近年来有不少研究表明，黄连和吴茱萸可通过免疫代谢途径有效治疗溃疡性结肠炎[6]；左金丸（黄连∶吴茱萸=6∶1）可能通过调控Tfh/Tfr 细胞平衡，以及结肠组织的Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达水平来改善溃疡性结肠炎小鼠肠黏膜损伤[7]。萸连丸能否通过影响mTfh 细胞亚群水平来发挥对溃疡性结肠炎的治疗效果尚不清楚。故本研究拟通过探讨萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠mTfh 细胞亚群水平的调控作用，为萸连丸治疗溃疡性结肠炎的免疫药理学研究提供实验依据。

1 材料与方法

1.1 动物 9 周龄雄性BALB/c 小鼠，SPF 级，体质量（20±2）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，实验动物生产许可证号：SCXK（湘）2019- 0004，动物质量合格证号：430727210100896848。动物饲养于江西中医药大学动物科技中心，恒温（20～26 ℃）、恒湿（相对湿度40%～70%），全价标准饲料喂养，适应性饲养1周后开始实验。本动物实验经过江西中医药大学实验动物伦理委员会批准，批文号：JZLLSC20210160。

1.2 药物及试剂 黄连，黄冈金贵中药产业发展有限公司，批号：D21030104；吴茱萸，江西樟树天齐堂中药饮片有限公司，批号：2109003；吴茱萸、黄连经江西中医药大学药学院胡生福教授鉴定分别为吴茱萸Euodiarutaecarpa（Juss.）的干燥成熟果实和黄连CoptischinensisFranch.的干燥根茎。美沙拉嗪肠溶片，葵花药业集团佳木斯鹿灵制药有限公司，批号：201121；葡聚糖硫酸钠（DSS，分子量为36 000～50 000），苏州天可公司，批号：025K2021；白细胞介素6（IL-6）ELISA 试剂盒（货号：MM-3660302）、白细胞介素15（IL-15）ELISA 试剂盒（货号：MM-0172M2），均购自江苏酶免实业有限公司；流式荧光抗体Anti-mouse APC-Cy7-CD4（货号：552051）、Anti-mouse APC-CCR7（货号：565868）、Anti-mouse FITC-CXCR5（货号：560577）、Anti-mouse PE-Cy7-CD62L（货号：560516）、Anti-mouse PE-GL7（货号：561530），均购自美国BD公司；WB抗体Anti-rabbit-AMPK-α（货号：AF6423）、Anti-rabbit-p-AMPK-α（货号：AF3423），均购自美国Affinity Biosciences公司；WB抗体Anti-rabbit-Roquin-1/2 clone 3F12 Antibody，德国Merck 公司，货号：MABF288；WB 抗体Antirabbit -GAPDH，英国Abcam公司，货号：ab181602；粪便隐血（FOB）检测试剂盒，珠海贝索生物公司，货号：B210102。

1.3 主要仪器 3001-1950 型全波长多功能酶标仪，美国赛默飞世尔科技公司；170-3930 型半干转膜仪、041BR137750 型电泳仪，美国BIO-RAD 公司；FluorChem M 型凝胶成像系统，美国ProteinSimple 公司；FACS-CantoⅡ型流式细胞仪，美国BD公司。

1.4 药物制备 取一定量的吴茱萸饮片，常规水煎煮3 次后过滤去渣，将滤液合并后浓缩至适量；将黄连饮片与吴茱萸水煎液按生药1∶1 的比例搅拌焖润，待水煎液被完全吸收后置于烘箱中烘干（100 ℃、2 h）；用多功能粉碎机将萸黄连粉碎后过2 号筛，备用；使用前以双纯水配制成浓度为0.025 g·mL-1的萸连丸溶液。用多功能粉碎机将美沙拉嗪肠溶片粉碎，用双纯水配制成浓度为0.015 g·mL-1的美沙拉嗪溶液。

1.5 分组、模型复制及给药 将40 只BALB/c 小鼠随机分为正常组、模型组、萸连丸组和美沙拉嗪组，每组10 只。参考相关研究[8]方法复制DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠模型：适应性喂养1周后，正常组小鼠给予正常饮用水，其余各组小鼠给予3% DSS 溶液自由饮用7 d，在第8 天开始改为正常饮用水；小鼠饮用DSS溶液后，每天进行粪便隐血试验。模型复制成功标准：采用贝索试纸法进行粪便隐血试验，检测小鼠粪便中有无血红蛋白，评分≥2 分即表明小鼠粪便潜血阳性，肠道出血、溃疡形成即可入组，否则排除入组。模型复制后第8天开始，按动物与人的体表面积换算给药剂量，萸连丸组给予0.5 g·kg-1萸连丸溶液灌胃，美沙拉嗪组给予0.3 g·kg-1美沙拉嗪溶液灌胃，给药体积均为20 mL·kg-1，正常组及模型组给予等容积生理盐水灌胃，每日1 次，连续7 d。实验过程每天记录小鼠的精神状态和体质量情况。

1.6 样本采集 第15 天以戊巴比妥钠麻醉小鼠，冰上分离结肠、脾脏组织。将结肠组织自然铺展于冰袋上，测量小鼠回盲部至肛门的结肠长度；用预冷的PBS缓冲液冲洗肠内容物并吸干水分，称取结肠质量，计算：结肠质量指数（%）=结肠质量（g）/小鼠体质量（g）×100%。将制备切片所需的距肛门3 cm 的结肠组织样本置于4%多聚甲醛溶液中固定保存；剩余结肠组织分装至冻存管并立即置于-80 ℃冰箱保存。

1.7 结肠组织病理形态学观察 4%多聚甲醛溶液固定1 周后，取0.5 cm 左右结肠组织；乙醇梯度脱水，二甲苯透明，经65 ℃石蜡浸泡1.5 h 后包埋，制备4 μm 切片；切片脱蜡后进行常规HE 染色，中性树胶封片后在光学显微镜下观察结肠组织病理变化[9]。

1.8 ELISA 法测定结肠组织中IL-6、IL-15 的表达水平 将结肠组织充分剪碎后，按100∶1∶1的比例分别加入RIPA 裂解液、Cocktail 和PMSF；在4 ℃冰箱中孵育40 min 后，用超声匀浆机研磨至充分裂解；置于高速冷冻离心机中以13 000 r·min-1（离心半径=14 cm）离心40 min，取上清。严格按照ELISA试剂盒说明书步骤操作，使用酶标仪在450 nm 波长下测定吸光度值，计算IL-6、IL-15的表达水平。

1.9 流式细胞术测定脾脏组织中mTfh 细胞亚群的表达情况 分离小鼠脾脏组织并研碎，加入红细胞裂解液，避光孵育15 min，制备单细胞悬液。取100 μL脾脏单细胞悬液于EP 管中，加入1 μg FC Block 阻断封闭，4 ℃下避光孵育5 min。加入相应体积的表面流式抗体CD4-APC-Cy7、CXCR5-FITC、CCR7-APC、CD62L-PE-Cy7、GL7-PE，混匀；室温下避光孵育30 min 后，用1 mL 1×Perm/Wash Buffer 洗涤2 次；加入500 μL Stain Buffer，定容后上机检测。采用FlowJo V10软件分析流式结果。

1.10 Western Blot 法测定结肠组织中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表达水平 制备结肠组织上清液，采用BCA 法测定样本蛋白浓度，并计算上样量。采用8%～10%的SDS-PAGE凝胶电泳分离蛋白，并将其转移至裁剪好的PVDF 膜上；5% BSA封闭2 h后，加入一抗［Roquin-1（1∶800）、AMPK-α（1∶1 500）、p-AMPK-α（1∶1 000）、GAPDH（1∶1 000）］，4 ℃摇床孵育过夜；TBST溶液洗涤3次后，加入二抗（1∶10 000），室温下孵育75 min，再洗涤后曝光并显影；采用ImageJ图像分析软件测定各蛋白条带灰度值，以GAPDH为内参，对目的蛋白进行半定量分析。

1.11 统计学处理方法 采用SPSS 25.0 统计软件进行数据分析；计量资料以均数±标准差（±s）表示；多组间比较采用单因素方差分析（One-way ANOVA），两两比较采用LSD检验；以P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠体质量、结肠长度、结肠质量及结肠质量指数的影响 结果见表1 。正常组小鼠精神状态良好，反应敏捷，善食好动，大便性状正常。与正常组比较，模型组小鼠精神萎靡，毛色暗淡，拱背聚群，食欲不佳，大便不成形，体质量显著下降（P＜0.01），结肠长度显著缩短（P＜0.01），结肠质量明显增加（P＜0.05），结肠质量指数显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，萸连丸组及美沙拉嗪组小鼠的体质量明显上升（P＜0.05），结肠长度显著延长（P＜0.01），结肠质量明显降低（P＜0.05），结肠质量指数显著下降（P＜0.01），小鼠精神状态及大便性状得到改善。结果表明，萸连丸可有效改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的症状。

表1 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠体质量、结肠长度、结肠质量及结肠质量指数的影响（±s，n=10）Table 1 Effects of Yulian Pills on body mass，colon length，colon mass and colon mass index of mice with ulcerative colitis（±s，n=10）

表1 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠体质量、结肠长度、结肠质量及结肠质量指数的影响（±s，n=10）Table 1 Effects of Yulian Pills on body mass，colon length，colon mass and colon mass index of mice with ulcerative colitis（±s，n=10）

注：与正常组比较，*P＜0.05，**P＜0.01；与模型组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常组模型组萸连丸组美沙拉嗪组剂量/（g·kg-1）--0.5 0.3体质量/g 22.56±0.93 20.93±1.05**22.98±1.54#22.03±0.77#结肠长度/cm 9.85±0.39 8.46±0.34**9.61±0.38##9.23±0.51##结肠质量/g 0.25±0.01 0.26±0.01*0.25±0.01#0.22±0.03#结肠质量指数/%1.10±0.02 1.28±0.01**1.12±0.03##1.00±0.11##

2.2 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理形态的影响 结果见图1。正常组小鼠结肠组织肠壁未见充血、水肿和增厚，黏膜光滑且腺体规整，肠上皮细胞排列整齐，隐窝结构完整，无炎性细胞浸润与溃疡。与正常组比较，模型组小鼠肠壁有所增厚且伴有充血水肿，肠壁完整性被破坏，腺体紊乱，肠上皮细胞排列错乱，隐窝结构变形，大量炎性细胞浸润和溃疡形成，结肠组织病理损伤严重。与模型组比较，萸连丸组及美沙拉嗪组小鼠的肠上皮细胞有不同程度修复，部分腺体增生，伴少量炎性细胞浸润与溃疡，结肠组织病理损伤得到较明显改善。结果表明，萸连丸可有效改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的结肠组织黏膜损伤。

图1 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织病理变化的影响（HE 染色）Figure 1 Effect of Yulian Pills on histomorphological changes in the colon of mice with ulcerative colitis（HE staining）

2.3 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中IL-6、IL-15 表达的影响 结果见表2。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中的促炎细胞因子IL-6、IL-15 表达水平显著升高（P＜0.01）。与模型组比较，萸连丸组及美沙拉嗪组小鼠结肠组织中的IL-6、IL-15 表达水平显著降低（P＜0.01）。结果表明，萸连丸能明显抑制DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中的促炎细胞因子IL-6、IL-15的表达水平。

表2 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中IL-6、IL-15表达的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Yulian Pills on the expressions of IL-6 and IL-15 in the colonic tissue of mice with ulcerative（±s，n=10）

表2 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中IL-6、IL-15表达的影响（±s，n=10）Table 2 Effect of Yulian Pills on the expressions of IL-6 and IL-15 in the colonic tissue of mice with ulcerative（±s，n=10）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，##P＜0.01

组别正常组模型组萸连丸组美沙拉嗪组剂量/（g·kg-1）--0.5 0.3 IL-6/（pg·mL-1）205.37±46.38 279.18±56.19**166.71±40.49##200.77±62.92##IL-15/（pg·mL-1）3 491.94±653.19 4 308.81±626.52**2 479.14±575.23##2 559.48±671.04##

2.4 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠脾脏组织中mTfh细胞亚群表达的影响 结果见图2。与正常组比较，模型组小鼠脾脏组织中CD4+CCR7-CXCR5+CD62L+、CD4+CCR7+CXCR5+GL7+、CD4+CCR7-CXCR5+GL7+细胞表达水平均显著升高（P＜0.01），而CD4+CCR7+CXCR5+CD62L+细胞表达水平显著降低（P＜0.01）。与模型组比较，萸连丸组及美沙拉嗪组小鼠脾脏组织中CD4+CCR7-CXCR5+CD62L+、CD4+CCR7+CXCR5+GL7+、CD4+CCR7-CXCR5+GL7+细胞表达水平显著降低（P＜0.01），而CD4+CCR7+CXCR5+CD62L+细胞表达水平显著升高（P＜0.01）。结果表明，萸连丸可有效调节DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠脾脏组织中mTfh细胞亚群GL7、CD62L的表达水平。

图2 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠脾脏组织中mTfh 细胞亚群表达的影响（x ±s，n=10）Figure 2 Effect of Yulian Pills on the expression of mTfh cell subpopulation in spleen of mice with ulcerative colitis（x ±s，n=10）

2.5 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表达的影响 结果见图3。与正常组比较，模型组小鼠结肠组织中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表达水平均明显降低（P＜0.05）。与模型组比较，萸连丸组及美沙拉嗪组小鼠结肠组织中的Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表达水平明显升高（P＜0.05，P＜0.01）。结果表明，萸连丸能够促进DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中Roquin-1/AMPK-α 通路的活化。

图3 萸连丸对溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中Roquin-1、AMPK-α、p-AMPK-α 蛋白表达的影响（±s，n=10）Figure 3 Effect of Yulian Pills on the protein expressions of Roquin-1，AMPK-α and p-AMPK-α in the colonic tissue of mice with ulcerative colitis（±s，n=10）

3 讨论

根据溃疡性结肠炎（UC）的临床表现，可将其归属于中医学的“肠澼”“便血”“泄泻”“痢疾”等疾病范畴。该病多因先天禀赋不足，后天失养，阴阳失调，加之感受外邪导致反复发作，脾虚肝旺为其主要病机之一[10]。根据法随证立、方从法出的原则，常选择萸连丸用于治疗肝脾失调型溃疡性结肠炎。研究[11]表明，萸连丸及其有效组分具有抗炎、抑菌等药理作用，可通过修复肠道黏膜损伤治疗溃疡性结肠炎。本研究结果显示，萸连丸可有效改善DSS诱导的溃疡性结肠炎小鼠的症状，结肠组织病理损伤得到较明显改善。

免疫记忆是免疫反应的核心法则，清除完抗原之后少部分未凋亡的效应性T细胞可进一步分化为效应记忆性T 细胞（Effector memory T cells，Tem）和中央记忆性T细胞（Central memory T cells，Tcm），两者以CD4+/CD8+来区分[12]。同样mTfh 细胞在受到抗原刺激前会较长时间有效存活于体内并处于休眠状态，当再次遇到同源抗原时会重新激活发挥免疫作用[13]。因此，mTfh 细胞在长效的抗体记忆反应中扮演重要角色。而免疫记忆功能的紊乱是溃疡性结肠炎反复发作的主要原因之一，因此，mTfh 细胞及其亚群的平衡是治疗溃疡性结肠炎的重要策略之一。研究[14]发现，黄芪多糖能够通过干预ATP/P2X7R 信号调控Tfh、mTfh 细胞及其亚群之间的平衡，从而对慢性溃疡性结肠炎小鼠发挥治疗作用。姜黄素能够通过调控结肠炎小鼠mTfh 细胞及其亚群细胞mTfh1/mTfr/mTfh17 的数量和比例，维持其平衡，进而减轻肥胖小鼠结肠炎的炎症反应和肠道黏膜损伤[15]。Tfh（CD4+CXCR5+T）细胞代表了一个新的辅助T 细胞亚群，根据表面趋化因子受体（CCR7）表达水平不同，可将mTfh 细胞分为中枢型记忆性Tfh 细胞（Central memory follicular T cells，Tcm-Tfh）和效应型记忆性Tfh 细胞（Effector memory follicular T cells，Tem-Tfh）2 种不同表型，即CD4+CXCR5+CCR7+T 细胞和CD4+CXCR5+CCR7-T 细胞。在本研究中对2 种不同表型的mTfh 细胞亚型进行了检测，结果发现萸连丸治疗后溃疡性结肠炎小鼠脾脏组织中的CD4+CCR7-CXCR5+CD62L+、CD4+CCR7+CXCR5+GL7+、CD4+CCR7-CXCR5+GL7+细胞表达水平显著下降，而CD4+CCR7+CXCR5+CD62L+细胞表达水平明显上升。结果表明，萸连丸可抑制溃疡性结肠炎小鼠的Tem-Tfh 细胞水平，促进Tcm-Tfh 细胞水平，通过维持其稳态进而有效缓解溃疡性结肠炎的炎症反应。

Tfh 经典的分化路径始于树突状细胞对初始CD4+T细胞的活化，IL-6与其受体相互作用，可诱导活化的CD4+T 细胞中BCL-6 的表达，因此IL-6 是诱导Tfh分化的关键性细胞因子[16]。另外，Roquin-1（Rc3h1）、Roquin-2（Rc3h2）蛋白能够抑制参与Tfh 细胞分化和迁移的ICOS 的表达，以下调BCL-6 表达，进而限制自发性Tfh细胞的分化和生发中心的形成，且ICOS和IL-6 存在协同作用，参与Tfh 细胞的分化[17]。研究[18]发现，在DSS 诱导的结肠炎模型中，Tfh 细胞炎症浸润与结肠组织病理学损伤评分呈正相关。因此，IL-6作为诱导Tfh 细胞分化的核心细胞因子在溃疡性结肠炎模型组中表达水平升高，治疗后其表达水平降低；而Roquin-1/2 蛋白负调控mTfh 细胞的分化，其在溃疡性结肠炎模型组中表达水平降低，治疗后表达水平升高，与本研究结果一致。AMPK 是细胞能量代谢的关键分子，与炎症的发生发展密切相关[19]。有研究[20]表明，四神丸可通过激活AMPK 来恢复细胞能量感应功能，进一步维持细胞能量稳态，以改善DSS诱导的结肠炎小鼠的结肠黏膜屏障损伤。在本研究中，经萸连丸治疗后，溃疡性结肠炎小鼠结肠组织中AMPK-α、p-AMPK-α蛋白表达水平明显升高，提示萸连丸可能通过调控AMPK信号以纠正细胞能量代谢紊乱，进而修复肠道黏膜屏障。有研究显示，Roquin-1 和AMPK-α 可直接相关且两者相互作用[21-22]，促炎细胞因子IL-15 在溃疡性结肠炎患者肠道黏膜中的表达水平明显高于正常人群[23]，与本研究结果一致。结果表明，萸连丸可能是通过激活Roquin-1/AMPK-α 信号通路，下调炎性细胞因子IL-6、IL-15 表达来实现对DSS 诱导的溃疡性结肠炎小鼠的治疗作用。

综上所述，萸连丸对DSS诱导的小鼠溃疡性结肠炎具有治疗作用，能够改善结肠组织病理损伤，可能与激活Roquin-1/AMPK-α 信号通路，下调炎性细胞因子IL-6、IL-15表达，调控mTfh细胞亚群稳态有关。但由于mTfh 细胞分离技术还不够成熟，尚未进行相关蛋白在靶细胞上表达水平的验证，且萸连丸调节mTfh 细胞的物质基础和作用靶点还有待进一步研究。