酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马内质网应激IRE1α/ASK1/JNK 通路的影响

施学丽，黄辰杰，范丽丽，马晓聪，郭超峰（.广西中医药大学壮医药学院，广西南宁 000；.广西中医药大学研究生院，广西南宁 000；.广西中医药大学药学院，广西南宁 000；.广西中医药大学学科办，广西南宁 000；. 广西中医药大学基础医学院，广西南宁 000）

抑郁症是最常见的精神障碍之一，预计到2030年抑郁症将成为危害人类健康的第二大疾病[1]。因此，如何有效防治抑郁症是亟待解决的问题。目前临床上常用的抗抑郁西药主要通过提高脑内单胺类神经递质水平发挥作用，但普遍存在起效缓慢、副作用大、作用靶点单一等问题，因此越来越多的研究者将研究重点投向中医药[2]。

内质网应激（endoplasmic reticulum stress，ERS）可通过触发多种促凋亡机制，对神经细胞产生有害作用，与抑郁症的发生密切相关[3-4]。肌醇依赖性激酶1α（inositol-requiring enzyme-1α，IRE1α）/凋亡信号调节激酶1（apoptosis signal-regulated kinase 1，ASK1）/c-Jun 氨基末端激酶（c-Jun N-terminal kinase，JNK）通路是目前研究较多、较清楚的由ERS 诱导的神经细胞凋亡通路，与抑郁症的发生密切相关[5-6]。

药对是历代医家的经验结晶，疗效确切，配伍精准，体现了中医用药特色优势，作为复方和单味药之间的桥梁，对其透彻的研究将有助于提高和推动中医药的整体理论和现代化的进程[7]。前期临床研究[8-9]证实，酸枣仁-合欢花药对能够“疏肝解郁、宁心安神”，具有抗抑郁功效。前期动物研究[10]发现，酸枣仁-合欢花药对能够减缓ERS，减少细胞凋亡数及细胞凋亡率，改善抑郁症状。因此，本实验以孤养结合慢性不可预见性温和应激（chronic unpredictable mild stress，CUMS）方法制备抑郁大鼠模型，探讨酸枣仁-合欢花抗抑郁作用机制是否与ERS 凋亡通路IRE1α/ASK1/JNK 有关，以冀为临床治疗抑郁症的用药提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 动物 SD 大鼠，雄性，SPF 级，8 周龄，体质量（180±20）g，购于湖南斯莱克景达实验动物有限公司，动物使用许可证号：SYXK（桂）2019-0001，动物质量合格证号：4307271103072775，饲养于广西中医药科学实验中心动物房，室温控制在24 ℃～26 ℃，相对湿度保持在55%～60%。动物实验经广西中医药大学实验动物福利伦理委员会批准，批准编号：DW20211206-189。

1.2 药物及试剂 炒酸枣仁、合欢花均购于广西仙茱中药科技有限公司，批号分别为：20210901、20210701，经广西中医药大学韦松基教授鉴定为正品。盐酸文拉法辛缓释片，购自成都康弘药业集团股份有限公司，批号：210816。TUNEL 细胞凋亡试剂盒，购自上海碧云天生物技术有限公司，批号：101322230120；Tri Quick Reagent 总RNA 提取试剂盒，购自北京索莱宝科技有限公司，批号：R1100；反转录试剂盒、荧光定量检测试剂盒，购自新贝生物科技有限公司，批号分别为：R202-02、Q204-1；兔抗大鼠IRE1α、磷酸化（P）-IRE1α、ASK1、PASK1、JNK、P-JNK、B 细胞淋巴瘤2（B cell lymphoma-2，Bcl-2）、Bcl-2 相关X 蛋白（Bcl-2 associated X protein，Bax）、胱天蛋白酶3（cysteme aspartate specific protease-3，Caspase-3）、甘油醛-3-磷酸脱氢酶（glyceraldehyde-3-phosphate dehydrogenase，GAPDH）及山羊抗兔二抗，购自武汉华联科生物技术有限公司，批号分别为：3294T、AF7150、PAB31055、AF3477、PAB30101、4668T、bs - 0127R、PAB30041、bs-0081R、PAB36269、SAB43714。

1.3 仪器 BW-OF302 旷场实验视频分析系统、BWMWM101 水迷宫，上海软隆科技公司；高速冷冻离心机iCEN-24R，杭州奥盛仪器有限公司；Tanon 5200 全自动化学发光分析仪，上海天能科技发展有限公司；Tecnai G220 Twin 透射电子显微镜，美国Thermo Fisher Scientific 公司；EM UC7 型超薄切片机，德国Leica 公司；Light cycler 480 II 荧光定量PCR 仪，瑞士Roche 公司；Mini Protean 3 cell 电泳仪，美国Bio-Rad公司。

1.4 分组、模型复制及给药 180 只大鼠适应性喂养1 周后，用旷场实验[11]筛选出总分在30～120 分之间的大鼠，挑选评分相近的144只大鼠，用随机数字表法分为正常组、模型组及酸枣仁-合欢花高、中、低剂量组和文拉法辛组，每组24只。

正常组不给予任何刺激，其他5 组孤养，并参照相关方法[12]进行模型复制，包括夹尾3 min、冷水游泳（4 ℃）5 min、食物剥夺24 h、湿笼饲养24 h、禁水24 h、连续过夜光照12 h和电击脚底（1 mA）2 min等7 种方法，整个过程持续3 周，制造孤养结合CUMS 抑郁大鼠模型。若旷场实验及水迷宫实验结果显示，与正常组大鼠比较，模型组旷场实验得分减少、学习记忆能力下降，说明模型复制成功。

用蒸馏水将酸枣仁-合欢花浸膏干粉配成生药含量1.6、0.8 、0.4 g·mL-1的悬浊液，盐酸文拉法辛配制成0.000 8 g·mL-1的混悬液。酸枣仁-合欢花高、中、低剂量组按10 mL·kg-1灌胃酸枣仁-合欢花悬浊液（相当于酸枣仁-合欢花生药量16、8、4 g·kg-1，为成人临床剂量的16、8、4 倍）；文拉法辛组按10 mL·kg-1灌胃盐酸文拉法辛混悬液；正常组、模型组按10 mL·kg-1灌胃蒸馏水，从模型复制的第1 天开始，每天1次，连续21 d。

1.5 大鼠行为学评分

1.5.1 旷场实验 应用BW-OF302 旷场实验视频分析系统，在实验第1 天及第21 天进行。在安静的环境中，将大鼠放入80 cm×80 cm×60 cm 的黑色敞箱中，箱底被划分为25 个大小相等正方形格子，将大鼠放到正中央格子内。大鼠身体50%以上进入一个方格内，则计水平活动得1 分；大鼠两前肢离开箱底一次，则计垂直活动得1 分。记录大鼠3 min 内的得分情况。

1.5.2 水迷宫实验 采用Morris 水迷宫检测大鼠的空间学习记忆能力，在实验第1 天及第21 天进行。该测试包括定位航行实验和空间探索实验。定位航行实验：Morris 水迷宫均分为4 个象限，将大鼠分别从每个象限面向池壁放入水中，观察大鼠找到高出水面2 cm 平台的时间，若120 s内未找到平台，则引导其至平台，并停留20 s，训练3 d；第4 天记录大鼠爬上平台所需的时间（即逃避潜伏期），若120 s 内没有找到平台即逃避潜伏期记为120 s。空间探索实验：第5天撤掉平台，由平台所在对侧象限放入大鼠，记录120 s内大鼠跨越原平台位置的次数。

1.6 透射电镜检测海马神经细胞超微结构 行为学实验结束后，随机从各组选出6 只大鼠，用3%戊巴比妥钠（1.5 mL·kg-1）腹腔注射麻醉后，断头处死大鼠。剥离海马组织，经4%戊二醛和1%四氧化锇固定，梯度酒精脱水，丙酮渗透，环氧树脂包埋。烤箱60 ℃聚合48 h，超薄切片机切片，乙酸铀及枸橼酸铅染色，透射电镜观察并拍照。

1.7 TUNEL 检测海马神经细胞凋亡 同“1.6”项下，随机从各组选出6 只大鼠，取海马组织，4%多聚甲醛灌注固定后，常规制备石蜡切片。切片经二甲苯脱蜡、乙醇脱水后，按照试剂盒说明书操作。细胞核呈棕黄色为凋亡细胞。每只大鼠各取切片1 张，利用CMIAS多功能真彩色病理图像分析系统在CA3区选取4个视野， 分析单个视野下凋亡细胞个数。

1.8 Western Blot 法检测大鼠海马IRE1α、P-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达 同“1.6”项下，随机从各组选出6只大鼠，取海马组织，将海马组织剪成细小的碎片，按每20 mg 组织加入200 μL 裂解液，离心取上清，BCA 法测蛋白浓度。取20 μg 蛋白，进行SDS-PAGE 电泳，湿转至PVDF 膜，4 ℃过夜，分别加入漂洗液稀释的一抗（IRE1α、P-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、Bcl-2、GAPDH 为1∶1 000，Bax、Caspase-3 为1∶2 000），4 ℃过夜，PBST 洗膜。加HRP 标记的山羊抗兔二抗（1∶20 000），37 ℃孵育，PBST 洗膜，ECL 显影曝光，应用TANON GIS 软件对目的条带进行分析。

1.9 Real-Time PCR 法检测海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase -3 mRNA 表达 同“1.6”项下，取各组剩余6 只大鼠的海马组织，研磨匀浆，高速离心，取上层液，使用Trizol 法提取总RNA，进行逆转录和扩增，以GAPDH 为内参，用2-△△CT法计算出各样品中目的基因的相对表达量。逆转录反应条件为：25 ℃、300 s；42 ℃、1 800 s；90 ℃、5 s。扩增反应条件为：95 ℃预变性180 s，95 ℃、5 s，56 ℃、10 s，72 ℃、25 s，45 个循环。引物由北京擎科生物科技有限公司合成，引物序列及产物长度见表1。

表1 PCR 引物序列及产物长度Table 1 PCR primer sequences and product lengths

1.10 统计学处理方法 运用IBM SPSS Statistics 26.0进行数据分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示，多组间比较采用单因素方差分析。符合方差齐性时，两两比较选用LSD 检验；方差不齐时，两两比较采用Tambane's T2 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠行为学的影响

2.1.1 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠旷场实验的影响 见图1。实验第1 天，各组大鼠的水平、垂直运动得分的差异无统计学意义（P＞0.05）。实验第21 天，与正常组比较，模型组大鼠水平、垂直运动得分均降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，酸枣仁-合欢花各剂量组及文拉法辛组大鼠水平、垂直运动得分均升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，酸枣仁-合欢花高、低剂量组大鼠水平、垂直运动得分均降低，差异有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

图1 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠旷场水平运动和垂直运动的影响（±s，n=24）Figure 1 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on horizontal and vertical motions of de open field（±s，n=24）

2.1.2 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠水迷宫实验的影响 见图2。实验第1 天，各组大鼠逃避潜伏期、跨越原平台次数的差异无统计学意义（P＞0.05）。实验第21 天，与正常组比较，模型组大鼠逃避潜伏期增加、跨越原平台次数减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，酸枣仁-合欢花各剂量组及文拉法辛组大鼠逃避潜伏期减少、跨越原平台次数增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，酸枣仁-合欢花高、低剂量组大鼠逃避潜伏期增加、跨越原平台次数减少，差异均有统计学意义（P＜0.01）。

图2 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠水迷宫逃避潜伏期及跨越原平台次数的影响（±s，n=24）Figure 2 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the avoidance latency of water maze and the number of crossing original platforms in depression model rats（±s，n=24）

2.2 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马神经细胞超微结构的影响 见图3。正常组大鼠海马神经细胞核显示为圆形或椭圆形，核膜清晰，线粒体外膜光滑、嵴数量较多，粗面内质网排列密集、整齐、结构正常。模型组大鼠海马神经细胞核不规则，部分核膜模糊，部分线粒体肿胀、外膜不清晰、嵴数量减少，粗面内质网的数量减少，并出现不规则扩张、折叠、断裂、盘曲。酸枣仁-合欢花高、中、低剂量组及文拉法辛组大鼠海马神经细胞核形态接近正常、核膜较光滑，线粒体轻度肿胀、外膜较光滑、嵴结构较清晰，粗面内质网结构清晰、未见明显扩张。

图3 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马神经细胞超微结构的影响（透射电镜，×5 000）Figure 3 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the ultrastructure of hippocampal neurocytes in depression model rats（TEM，×5 000）

2.3 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡的影响见图4、表2。与正常组比较，模型组大鼠海马神经细胞凋亡数增加，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，酸枣仁-合欢花各剂量组及文拉法辛组大鼠海马神经细胞凋亡数减少，差异有统计学意义（P＜0.01）；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，酸枣仁-合欢花高、低剂量组大鼠海马神经细胞凋亡数增多，差异有统计学意义（P＜0.01）。

图4 各组大鼠海马神经细胞凋亡情况（TUNEL 法，×400）Figure 4 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on apoptosis of hippocampal neurocytes in each group of rats（TUNEL，×400）

表2 各组大鼠海马神经细胞凋亡情况比较（±s，n=3）Table 2 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on apoptosis of hippocampal neurocytes in depression model rats（±s，n=3）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，▲▲P＜0.01

组别正常组模型组酸枣仁-合欢花高剂量组酸枣仁-合欢花中剂量组酸枣仁-合欢花低剂量组文拉法辛组剂量/（g·kg-1）--1 6 8 4 0.008细胞凋亡数/个2.67±0.82 10.50±0.55**8.00±0.63△△▲▲5.50±0.84△△8.17±0.98△△▲▲5.83±0.75△△

2.4 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马IRE1α/ASK1/JNK 通路蛋白表达的影响见图5、表3。 与正常组比较，模型组大鼠海马P-IRE1α/IRE1α、PASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白表达升高，Bcl-2 蛋白表达降低，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，酸枣仁-合欢花各剂量组及文拉法辛组大鼠海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白表达降低，Bcl-2蛋白表达升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，酸枣仁-合欢花高、低剂量组大鼠海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白表达升高，Bcl-2蛋白表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

图5 各组大鼠海马IRE1α、P-IRE1α、ASK1、P-ASK1、JNK、P-JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达条带图Figure 5 Protein expression band of IRE1 α， P-IRE1 α，ASK1， P-ASK1，JNK，P-JNK，Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of rats in each group

表3 各组大鼠海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达比较（±s，n=6）Table 3 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the protein expressions of P-IRE1α/IRE1α， P-ASK1/ASK1， P-JNK/JNK， Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

表3 各组大鼠海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 蛋白表达比较（±s，n=6）Table 3 Effect of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the protein expressions of P-IRE1α/IRE1α， P-ASK1/ASK1， P-JNK/JNK， Bax，Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△△P＜0.01；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别正常组模型组酸枣仁-合欢花高剂量组酸枣仁-合欢花中剂量组酸枣仁-合欢花低剂量组文拉法辛组剂量/（g·kg-1）--1 6 8 4 0.008 P-IRE1α/IRE1α 0.41±0.04 0.96±0.11**0.67±0.04△△▲0.57±0.08△△0.69±0.08△△▲▲0.58±0.03△△P-ASK1/ASK1 0.41±0.01 0.94±0.05**0.67±0.02△△▲▲0.56±0.06△△0.70±0.02△△▲▲0.59±0.02△△P-JNK/JNK 0.38±0.03 0.93±0.07**0.64±0.05△△▲▲0.56±0.03△△0.70±0.03△△▲▲0.60±0.04△△Bax 0.24±0.01 0.95±0.02**0.45±0.02△△▲▲0.35±0.05△△0.46±0.04△△▲▲0.37±0.03△△Bcl-2 0.73±0.02 0.34±0.02**0.45±0.02△△▲▲0.58±0.02△△0.46±0.01△△▲▲0.59±0.02△△Caspase-3 0.21±0.01 0.38±0.01**0.35±0.01△△▲▲0.27±0.01△△0.34±0.02△△▲▲0.28±0.01△△

2.5 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表达的影响 见表4。与正常组比较，模型组大鼠海马中IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA 表达水平升高，Bcl-2 mRNA 表达下降，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型组比较，酸枣仁-合欢花各剂量组及文拉法辛组大鼠海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA 表达降低，Bcl-2 mRNA 表达升高（P＜0.05，P＜0.01）；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，酸枣仁-合欢花高、低剂量组大鼠海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达升高，Bcl-2 mRNA 表达降低，差异均有统计学意义（P＜0.05，P＜0.01）。

表4 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表达的影响（±s，n=6）Table 4 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the mRNA expressions of IRE1α， ASK1， JNK， Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

表4 酸枣仁-合欢花对抑郁模型大鼠海马IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Bcl-2、Caspase-3 mRNA 表达的影响（±s，n=6）Table 4 Effects of Ziziphi Spinosae Semen-Albiziae Flos on the mRNA expressions of IRE1α， ASK1， JNK， Bax， Bcl-2 and Caspase-3 in hippocampus of depression model rats（±s，n=6）

注：与正常组比较，**P＜0.01；与模型组比较，△P＜0.05，△△P＜0.01；与酸枣仁-合欢花中剂量组比较，▲P＜0.05，▲▲P＜0.01

组别正常组模型组酸枣仁-合欢花高剂量组酸枣仁-合欢花中剂量组酸枣仁-合欢花低剂量组文拉法辛组剂量/（g·kg-1）--1 6 8 4 0.008 IRE1α 1.00±0.01 2.00±0.10**1.78±0.05△△▲▲1.56±0.06△△1.79±0.08△△▲▲1.56±0.07△△ASK1 1.02±0.05 1.88±0.06**1.67±0.07△△▲▲1.46±0.06△△1.68±0.08△△▲▲1.45±0.08△△JNK 1.00±0.06 2.57±0.07**2.07±0.44△△▲1.86±0.07△△2.09±0.13△△▲1.85±0.06△△Bax 1.02±0.08 2.38±0.16**1.70±0.09△△▲▲1.26±0.08△△2.23±0.14△▲▲1.22±0.10△△Bcl-2 1.01±0.08 0.34±0.05**0.54±0.05△△▲▲0.72±0.05△△0.40±0.02△▲▲0.71±0.06△△Caspase-3 1.00±0.05 1.88±0.06**1.52±0.05△△▲▲1.28±0.06△△1.50±0.12△△▲▲1.29±0.09△△

3 讨论

抑郁症属中医“郁证”范畴，其发生与心肝关系密切，课题组认为“心肝失调”是抑郁症致病的核心因素，肝气郁结、心神不安为抑郁症的基本病机，“疏肝解郁、宁心安神”为基本治法。 酸枣仁-合欢花药对为临床常用的治疗抑郁症的药对[13-15]，查阅中国知网中国专利发现，截至2023 年10 月，同时含有酸枣仁、合欢花，且可以治疗抑郁症的专利有32 项之多。酸枣仁酸甘收敛心阴，合欢花甘苦能解肝郁；心阴得收则心神得宁，肝郁得疏则情志愉悦。二者合用，“疏肝解郁，宁心安神”的作用集中。前期的研究[10，16-17]发现酸枣仁-合欢花能增强孤养结合CUMS抑郁模型大鼠海马及皮质ERK/CREB、BDNF/TrkB 信号传导通路，抑制PERK/ATF4/CHOP 通路，发挥抗抑郁作用。

孤养结合CUMS 抑郁大鼠模型是目前被较为公认的类似于人类抑郁的动物模型，在抗抑郁药物的选择与作用机制的研究中使用广泛[18-19]，能够很好地模拟抑郁症的临床症状。旷场实验是评价动物行为学的经典方法之一，抑郁状态下，动物的行为活动得分降低。抑郁症常伴随着认知功能障碍，其中学习记忆损伤尤为明显[20]。 水迷宫实验是评价动物学习、记忆功能最常用、最经典的方法[21]。本研究结果显示，模型大鼠表现为旷场实验得分减少、空间学习记忆能力下降，说明孤养结合CUMS抑郁大鼠模型复制成功；而酸枣仁-合欢花高、中、低剂量均能增加旷场实验得分、改善空间学习记忆能力，表明酸枣仁-合欢花具有抗抑郁的功效。

研究提示抑郁症的发病机制与ERS反应通路被持续激活有关，ERS成为抑郁症诊断及治疗的新生物学标志物及靶点[22-23]。本实验发现孤养结合CUMS 抑郁模型大鼠海马神经细胞凋亡数增加，神经细胞核膜模糊，线粒体肿胀、嵴数量减少，粗面内质网的数量减少、排列不规则，说明孤养结合CUMS刺激使大鼠海马神经细胞发生ERS，而酸枣仁-合欢花治疗后，大鼠海马神经细胞凋亡数降低、神经细胞受损程度明显减轻，说明对药酸枣仁-合欢花能够减缓ERS。

IRE1α 是内质网的Ⅰ型跨膜蛋白，能通过管腔结构域检测内质网中错误折叠的蛋白质。当ERS 持续存在时，IRE1α可以通过自身的二聚化和磷酸化而激活，P-IRE1α 与肿瘤坏死因子受体相关因子2（TNF receptor associated factor 2，TRAF2）形成复合体，引起ASK1 的活化，并促使其下游JNK 的磷酸化激活，P-JNK 一方面激活促凋亡因子Bax，另一方面抑制了抗凋亡因子Bcl-2 等的表达，从而诱导细胞凋亡。另外，P-JNK 还能作用于线粒体，导致细胞色素C的大量释放，并最终作用于Caspase-3，诱发细胞凋亡。本实验结果显示，孤养结合CUMS抑郁模型大鼠海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA 表达水平升高，Bcl-2 蛋白及mRNA 表达水平降低，与前人的研究[24]结果一致。而不同剂量的酸枣仁-合欢花均能明显降低孤养结合CUMS 抑郁模型大鼠海马P-IRE1α/IRE1α、P-ASK1/ASK1、P-JNK/JNK、Bax、Caspase-3 蛋白及IRE1α、ASK1、JNK、Bax、Caspase-3 mRNA表达，升高Bcl-2蛋白及mRNA表达水平。说明酸枣仁-合欢花能够抑制IRE1α/ASK1/JNK凋亡通路，并且中剂量组效果更为明显。

综上所述，酸枣仁-合欢花的抗抑郁作用机制可能与抑制ERS 凋亡通路IRE1α/ASK1/JNK 活性，促进海马神经细胞的修复、再生，拮抗神经细胞凋亡有关。结合前期的研究成果，说明酸枣仁-合欢花发挥抗抑郁作用可能是通过多靶点、多途径、多部位协同作用实现的。本研究仍存在不足之处，酸枣仁-合欢花抗抑郁的药理学研究目前仍停留在整体药理学水平。下一步，我们将结合血清及脑脊液药理学，对酸枣仁-合欢花抗抑郁的有效部位及药动学进一步深入研究，以期为临床精准用药提供实验依据。