基于上皮细胞-间充质转化的搜风愈喘方调控哮喘大鼠气道重塑的机制研究

李艳丽，张宇婧，闫永彬（1. 河南中医药大学第一附属医院儿科医院，河南郑州 450000；2. 河南中医药大学儿科医学院，河南郑州 450000）

支气管哮喘（哮喘）是一种包括气道上皮细胞等多种细胞及细胞组分参与的常见的慢性气道炎症性疾病，主要临床表现为反复发作的咳嗽、喘息、气促、呼吸困难，是儿童最常见的慢性呼吸系统疾病[1-2]。其在世界范围内呈现高发病率，且患病率在近几十年呈现显著上升趋势[3]。约有3.34 亿人受到影响并且发达国家该病的患病率明显高于发展中国家，但由于环境和生活方式的改变，发展中国家哮喘患病率正在迅速上升[4]，其主要影响儿童[5]。我国该病的患病率为4.2%[6]。气道炎症反应、气道重塑和气道高反应性是哮喘的主要病理特征，而气道炎症是其本质，气道重塑是其关键病理特征，与哮喘的反复发作、持续状态和不良预后有关[7-8]。作为气道重塑的核心机制，上皮细胞-间充质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）不仅在气道重塑的发生和发展过程中发挥重要作用[9-10]，而且可诱导气道上皮敏感性改变而影响严重哮喘糖皮质激素的治疗效应，也是不同病情严重程度的哮喘上皮屏障功能丧失的重要发病机制[11]。因此，气道EMT 的机制研究和药物如何干预尤为重要。

目前地塞米松等糖皮质激素仍是哮喘治疗的一线用药，虽有一定疗效，但存在治疗周期长、有副作用、难以根治等问题，且患儿对激素的依从性较差，导致目前临床对哮喘的控制并不理想。中医药治疗哮喘历史悠久，理论较为完善，治疗儿童哮喘效果显著[12]，能够明显改善症状、减少复发、减少不良反应[13]。课题组前期致力于小儿呼吸与感染相关方面的研究，基于小儿独特的生理病理特点，在“五脏有余不足”“久病入络”等学说的基础上提出“伏风暗瘀宿痰”的哮喘中医病机理论[14]，并创立了祛风、化痰、活血法并施的“搜风愈喘方”，临床疗效确切[15]。课题组既往实验研究已证实本方具有抗过敏、调控细胞外基质及抑制血管重塑作用，并通过抑制转化生长因子β1（TGF-β1）、血管内皮生长因子（VEGF）的表达而抑制哮喘大鼠气道重塑[16]。相关临床研究[17]表明，哮喘急性期的患儿在本方的干预下，咳嗽、喘息等症状明显改善，疗效优于西药对照组，其安全性良好。

EMT 是指上皮细胞在一定条件下，暂时失去细胞极性，获得迁移能力，形态发生间充质细胞表型改变的过程[8]，关键变化在于上皮细胞紧密连接的Ecadherin 表达的下调，N-cadherin、α-SMA 等间充质标志物表达的上调[18-19]。而TGF-β1 作为上皮间质转化的关键诱导因子之一，在此过程中扮演着重要角色，气道上皮细胞可在TGF-β1 的作用下发生EMT，进而参与哮喘气道重塑的发生发展[20]。因此，本研究选取SD 大鼠进行动物学实验，通过检测血清中的TGF-β1、白细胞介素（IL）-17含量及肺组织中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的表达，探讨搜风愈喘方能否通过调控上皮间质转化从而抑制气道重塑。

1 材料

1.1 动物 60 只SD 大鼠，雄性，SPF 级，6 周龄，体质量为（200 ± 20）g，北京华阜康生物科技股份有限公司提供，动物质量合格证号：110322221102192468，动物生产许可证号：SCXK（京）2019-0008，动物使用许可证编号：SYXK（豫）2021-0015。大鼠饲养于郑州大学实验动物中心，室内温度24～26 ℃，室内湿度55% ～65%，12 h/12 h 光暗循环，饲喂普通饲料，自由饮食。本研究经郑州大学伦理委员会批准，批准号：ZZU-LAC20220729[07]。

1.2 药物及试剂 搜风愈喘方的组方为：炒莱菔子、炒苦杏仁、党参、焦山楂、地龙、炒白僵蚕、炙枇杷叶、礞石、蜜麻黄、橘络、蝉蜕、红花、炙甘草，药材购自河南张仲景大药房股份有限公司；10%卵清蛋白（OVA），美国Sigma 公司，批号：A5503；1% 卵清蛋白（OVA），美国Sigma 公司，批号：A5253；氢氧化铝佐剂，美国Pierce 公司，批号：77161；醋酸地塞米松片，上海麦克林生化科技有限公司，规格：每片0.75 mg，批号：2010072；4%多聚甲醛通用型组织固定液，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：BL539A；PBS 缓冲液，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：GA2112011；0.9% NaCl，河南科伦药业有限公司，批号：C1220724E1；盐酸氯胺酮注射液，福建古田药业有限公司，批号：H35020148；IL-17 酶联免疫吸附测定试剂盒，联科生物有限公司，批号：A31720113。TGF-β1 酶联免疫吸附测定试剂盒，武汉伊莱瑞特公司，批号：FME1TGZM7K ；BCA 蛋白定量检测试剂盒，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号：G2026；TGF-β1 一抗，北京博奥森生物技术有限公司，批号：BS-0086R；E-cadherin、N-cadherin、α-SMA 一抗和二抗，武汉赛维尔生物科技有限公司，批号分别为：GB11082、GB11135、GB111364、GB23303。

1.3 仪器 NE-C28P压缩雾化器，欧姆龙（中国）有限公司； RT-6100 酶标仪， 美国Rayto 公司；alphaEaseFC 灰度分析软件，美国Alpha Innotech 公司；Adobe PhotoShop 图像分析软件，美国Adobe 公司；6100 化学发光仪，上海CLINX 公司；SVE-2 垂直电泳仪、KZ-Ⅱ研磨仪，武汉赛维尔生物科技有限公司；Leica UC7 型病理切片机，上海徕卡公司；D3024R 台式高速冷冻离心机，北京DRAGONLAB 公司；TL-988 荧光定量PCR 仪，西安天隆公司；HT7700透射电子显微镜，日本HITACHI公司。

2 方法

2.1 搜风愈喘方药液制备 搜风愈喘方中药饮片以纯水浸泡30 min，加热至沸腾后以文火煎煮30 min，倒出药液并过滤；残渣复煎，倒出药液，将2次药液混合，置于70 ℃恒温水浴，药液浓缩至1.26、0.63、0.315 g·mL-13种浓度，4 ℃恒温冰箱保存。

2.2 分组及模型复制 取60 只SD 大鼠普通饲料饲喂1 周，将其随机均分为6 组，分别为正常对照组、模型对照组、地塞米松组及搜风愈喘方高、中、低剂量组。参考相关文献研究[21]，复制哮喘大鼠模型。除正常组外，其余各组均采用卵清蛋白（OVA）致敏和激发建立哮喘大鼠模型。具体方案如下：实验第l 天和第7 天，每只大鼠给予10% 卵清蛋白1 mL、氢氧化铝100 mg 五点注射致敏。致敏开始两周后，将大鼠置于密闭透明容器内，给予1%卵清蛋白（卵清蛋白溶于生理盐水）雾化吸入激发哮喘。观察并记录大鼠呼吸及全身情况。开始连续3 d，后隔日雾化1 次，每次20 min，共21 d。以出现呼吸加快、点头呼吸、打喷嚏、精神萎靡不振、口周发绀及腹肌痉挛为激发成功[22]。

2.3 给药方法 各组大鼠每次雾化吸入激发前0.5 h给予相应药液进行灌胃。根据成人与大鼠的体质量换算公式得出大鼠用药量：dB=dA×6.25（dA、dB 分别代表成人、大鼠每日每千克体质量用药剂量）[23]。搜风愈喘方高、中、低剂量组分别按照1.26、0.63、0.315 g·mL-13 种浓度，每鼠按0.02 mL·g-1剂量每日灌胃给药1 次；地塞米松组给予0.125 mg·kg-1，等容灌胃，每日1次；正常组、模型组给予等量生理盐水灌胃，每日给药1次，连续21 d。期间观察并记录各组大鼠的一般情况。

2.4 标本采集 末次给药24 h后，腹腔注射50 mg·kg-1氯胺酮麻醉实验大鼠，腹主动脉取血，室温静置1 h；4 ℃条件下，以离心半径为13 cm、3 000 r·min-1离心15 min，取上清液，-80 ℃冰箱冷藏，以备检测血清指标。快速解剖大鼠、摘取合适大小的肺脏组织，PBS 缓冲液冲洗干净、置于-80 ℃冰箱冻存，以备检测mRNA 及蛋白质的表达；另取部分新鲜肺组织，以备HE染色和透射电镜检查。

2.5 指标检测

2.5.1 大鼠一般情况 观察并记录各组大鼠雾化激发及药物干预前后各阶段的体质量、饮食、情绪、活动强度、精神状态、呼吸频率、毛发色泽、口唇黏膜颜色变化及腹壁是否有凹陷等表现。

2.5.2 血清检测 ELISA 法测定血清TGF-β1、IL-17的含量，按试剂盒说明书操作。

2.5.3 病理学观察 取未灌洗过的左上叶肺组织，用4%多聚甲醛固定48 h，酒精脱水石蜡包埋切片，厚度为5 μm。行HE 染色，置于显微镜下放大200 倍，光镜下观察肺组织病理变化，并根据相关文献研究[24]对肺组织炎症浸润程度进行评分。

2.5.4 肺组织透射电镜检查 取合适大小的新鲜肺组织，迅速投入电镜固定液4 ℃固定2～4 h，用0.1 mol·L-1磷酸漂洗液进行漂洗3 次，之后用1%锇酸室温固定2 h。再次漂洗后，将组织依次放入不同浓度的酒精中脱水，每次15 min，100%丙酮2 次，每次15 min。然后用丙酮和812 包埋剂按不同比例对样品进行渗透，插入包埋板后于37 ℃烤箱过夜，60 ℃烤箱聚合48 h。将其用超薄切片机60～80 nm超薄切片，进行铀铅双染色，透射电镜观察肺组织上皮细胞、平滑肌细胞的超微结构。

2.5.5 RT-PCR 法检测肺组织mRAN 表达 取合适大小的肺脏组织，PBS缓冲液冲洗干净，按照试剂盒说明书提取肺组织总RNA。然后使用逆转录试剂盒反转录成cDNA，将其配置为相应的反应液，参照说明书进行扩增，反应程序为95 ℃、15 s，60 ℃、30 s，40个扩增循环。根据2-ΔΔCt公式计算TGF-β1、α-SMA、N-cadherin和E-cadherin mRNA 的相对表达量。引物由武汉赛维尔生物科技有限公司合成，引物序列见表1。

表1 引物序列及扩增长度Table 1 Primer sequences and amplification lengths

2.5.6 Western Blot法检测肺组织蛋白表达 取适量大鼠右肺组织，加入蛋白裂解液使之完全裂解，静置、离心后提取上清液。参照BCA 蛋白浓度测定试剂盒说明书测蛋白浓度，然后按比例加入5×还原型蛋白上样缓冲液，充分混匀，100 ℃煮沸10 min，备用。按步骤完成上样、电泳、转膜、封闭抗体、孵育一抗、孵育二抗、显影、条带分析，比较不同组间肺组织的TGF-β1、α-SMA、N-cadherin 和E-cadherin蛋白表达水平。

2.6 统计学处理方法 采用SPSS 26.0 软件进行分析，实验数据均以均值±标准差（±s）表示。对数据进行正态分布和方差齐性检验，符合正态分布的各组相关数据满足方差齐性，采用单因素方差分析，两两比较采用LSD 检验。以P＜0.05 为差异有统计学意义。

3 结果

3.1 各组大鼠一般情况 正常对照组大鼠精神状态良好，情绪稳定，呼吸频率、饮食、活动正常，毛色光泽，体质量增长。模型对照组大鼠呼吸急促，烦躁不安，易激惹，口唇发绀，皮毛枯槁，体质量增长不明显或有减轻。各治疗组大鼠精神状态、呼吸、饮食、活动等方面均较模型对照组明显改善。

3.2 各组大鼠肺组织病理情况 HE 染色和炎症评分结果见图1、图2。正常对照组大鼠支气管、肺组织结构完整，肺泡结构清晰，未见增厚及明显的炎症细胞浸润；与正常对照组比较，模型对照组大鼠气道壁及肺泡壁明显增厚，视野内可见大量炎症细胞浸润，炎症评分明显升高（P＜0.01）；各用药组与模型对照组比较，肺组织炎症细胞浸润减轻，支气管壁及肺泡壁增厚程度减轻，地塞米松组和搜风愈喘方高剂量组炎症评分明显降低（P＜0.05）。

图1 搜风愈喘方各剂量对哮喘大鼠模型肺组织炎症程度的影响（HE 染色，×200）Figure 1 Effect of Soufeng Yuchuan Formula on the degree of lung tissue inflammation in asthmatic rat model of each dose group（HE staining，×200）

图2 搜风愈喘方各剂量对哮喘大鼠模型肺组织炎症评分的影响（±s，n=10）Figure 2 Effect of Soufeng Yuchuan Formula on pulmonary tissue inflammation score in asthmatic rat model of eachdosegroup（±s，n=10）

3.3 各组大鼠肺组织超微结构情况 见图3。与正常对照组比较，模型对照组大鼠上皮细胞水肿程度严重，胞内基质局部溶解、变淡，细胞器肿胀明显；各用药组与模型对照组比较，肺组织中上皮细胞水肿程度明显减轻，细胞膜完整，胞内基质均匀，细胞器大多轻微肿胀。

图3 搜风愈喘方对哮喘大鼠模型肺组织上皮细胞超微结构的影响（透射电镜，×2 500）Figure 3 Effect of Soufeng Yuchuan Formula on ultrastructure of lung epithelial cells in asthmatic rat model of each dose group（Transmission electron microscope，×2 500）

3.4 各组大鼠血清中TGF-β1、IL-17 的含量 见表2。ELISA 结果显示，与正常对照组比较，模型对照组血清中TGF-β1、IL-17 含量显著升高，差异有统计学意义（P＜0.01）；与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方高、中、低剂量组大鼠血清TGF-β1、IL-17 含量明显下降，差异有统计学意义（P＜0.01，P＜0.05）；搜风愈喘方各剂量组间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表2 各组大鼠血清中TGF-β1、IL-17 含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TGF-β1 and IL-17 in serum of rats in each group（±s，n=10）

表2 各组大鼠血清中TGF-β1、IL-17 含量（±s，n=10）Table 2 Contents of TGF-β1 and IL-17 in serum of rats in each group（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，**P＜0. 01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型对照组地塞米松组搜风愈喘方高剂量组搜风愈喘方中剂量组搜风愈喘方低剂量组TGF-β1/（pg·mL-1）58.10±3.49 112.34±12.67**67.07±9.92##68.97±9.77##72.82±17.80##84.60±12.96#IL-17/（pg·mL-1）13.67±2.56 23.88±1.85**16.09±2.48##16.69±1.33##18.59±1.72##19.92±1.92#

3.5 各组大鼠肺组织中 TGF-β1、α-SMA、Ncadherin 和E-cadherin 的mRNA 表达 见表3。与正常对照组比较，模型对照组TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin mRNA 表达明显上调（P＜0.01），Ecadherin mRNA 表达显著下调（P＜0.01）；与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方各剂量组TGFβ1、α-SMA 和N-cadherin mRNA 表达显著下调（P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin mRNA 表达显著上调（P＜0.05，P＜0.01）；搜风愈喘方各剂量组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

表3 各组大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的mRNA 表达水平（±s，n=10）Table 3 mRNA expression levels of TGF-β1，α-SMA，Ncadherin and E-cadherin in lung tissues of rats in each group（±s，n=10）

表3 各组大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的mRNA 表达水平（±s，n=10）Table 3 mRNA expression levels of TGF-β1，α-SMA，Ncadherin and E-cadherin in lung tissues of rats in each group（±s，n=10）

注：与正常对照组比较，**P＜0.01；与模型对照组比较，#P＜0.05，##P＜0.01

组别正常对照组模型对照组地塞米松组搜风愈喘方高剂量组搜风愈喘方中剂量组搜风愈喘方低剂量组TGF-β1 1.00±0.00 4.28±0.82**1.71±0.44##1.94±0.65##2.61±1.22#2.94±0.56#α-SMA 1.00±0.00 2.71±0.93**0.65±0.49##0.81±0.36##1.08±0.30##1.50±0.33#E-cadherin 1.00±0.00 0.32±0.18**0.77±0.15##0.75±0.17##0.70±0.04##0.59±0.08#N-cadherin 1.00±0.00 4.02±0.39**1.25±0.12##1.55±0.12##2.07±0.28##2.93±0.56##

3.6 各组大鼠肺组织中的TGF-β1、α-SMA、Ncadherin、E-cadherin 蛋白表达比较 见图4。与正常对照组比较，模型对照组大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 表达显著上调（P＜0.01），Ecadherin 表达显著下调（P＜0.01）；与模型对照组比较，地塞米松组和搜风愈喘方各剂量组TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 表达明显下调（P＜0.05，P＜0.01），E-cadherin 表达明显上调（P＜0.01）；搜风愈喘方各剂量组之间比较，差异无统计学意义（P＞0.05）。

图4 各组大鼠肺组织中TGF-β1、α-SMA、N-cadherin、E-cadherin 的蛋白表达水平（±s，n=10）Figure 4 Protein expression levels of TGF-β1，α-SMA，N-cadherin and E-cadherin in lung tissues of rats in each group（±s，n=10）

4 讨论

气道重塑能导致持续性气道阻塞、气道高反应性和肺功能下降，是支气管哮喘发生发展进程中的重要环节，也是哮喘缠绵难愈的重要因素[25]。气道重塑的发生主要与气道上皮反复损伤和异常修复有关。气道上皮细胞是抵御外部病原体的第一道屏障，是最具活性的分泌组织细胞之一，在上皮细胞间充质转化和气道重塑中发挥关键作用[26]。气道上皮损伤后，释放细胞因子、TGF、成纤维细胞生长因子（fibroblast growth factor，FGF）等物质，可以促进上皮细胞自我修复，增强细胞迁移能力[27]，通过间质转化产生胶原沉积和上皮下纤维化过程，参与气道重塑。对气道壁波形蛋白的定量研究发现间质细胞有30%来源于上皮细胞的转化，表明EMT 对于气道重塑的重要性[19]。而EMT 的关键变化，具体表现为连接蛋白、细胞间紧密连接的丧失，尤其是E-cadherin表达的下调，导致上皮通透性增加，N-cadherin、α-SMA 表达的上调[28]。TGF-β1 通过诱导成纤维细胞的增殖和化学吸引在气道重塑中起核心作用，被认为是诱导EMT 的“主开关”，是气道重塑的促进剂[29-30]。袁星星等[8]发现平喘颗粒能通过抑制哮喘模型小鼠TGF-β1 的表达，抑制EMT 的发生，进而减轻气道重塑。于洋等[31]通过对小鼠哮喘模型的研究证实哮喘模型小鼠中存在EMT 和气道重塑，且TGF-β1过度表达，抑制EMT可减轻气道重塑。

在本研究中，我们观察到OVA 诱导的大鼠哮喘模型较正常对照组在精神、饮食等方面表现较差，气道壁及肺泡壁明显增厚，炎症细胞浸润明显，外周血中TGF-β1、IL-17 明显升高；给予搜风愈喘方各剂量干预后，哮喘大鼠一般情况较模型组均有改善，气道壁及肺泡壁增厚减轻，炎症细胞浸润缓解，外周血中TGF-β1、IL-17 明显下降，肺组织中TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 表达水平下调，E-cadherin 表达水平上调，以地塞米松和搜风愈喘方高剂量作用明显。糖皮质激素能通过抑制Ⅱ型辅助性T 细胞（T helper cell 2，Th2）募集并下调Th2 因子的产生，发挥显著的抗炎、抗水肿、免疫抑制作用，临床以其作用显著被认为是治疗支气管哮喘的一线药物，但部分使用激素的患者会出现激素抵抗现象，或者不良反应，导致疾病控制不佳[32]。中医药以其疗效确切，安全性高，在治疗哮喘方面发挥着积极作用。课题组基于小儿独特的生理病理特点，在“五脏有余不足”“久病入络”等学说的基础上提出“伏风暗瘀宿痰”的哮喘中医病机理论，并创立搜风愈喘方。方中用虫类药物，如炒白僵蚕、蝉蜕、地龙，深入肺脉以搜“伏风”，研究表明以上虫类药物组合可通过调节T-bet、GATA-3 的表达，抑制Th1 型细胞因子向Th2漂移，从而调节哮喘免疫失衡，减轻哮喘的气道炎症，疗效显著[23]。气行则血行，气虚则运血无力，故用党参、炙甘草健脾益气，以助血行；炒莱菔子、焦山楂以消食滞痰瘀；红花活血化瘀。研究表明此“消暗瘀”的药物组合可抑制PI3K-Akt通路的激活，降低IL-6、VEGF-A的表达，减轻气道炎症，延缓气道重塑[33]。并以蜜麻黄、炒苦杏仁、橘络、炙枇杷叶、礞石降气化痰以祛“宿痰”，此祛宿痰药物的配伍可通过山柰酚、异鼠李素、槲皮素等核心成分发挥抗炎、调节免疫等作用，从而延缓哮喘的发展。搜风愈喘方兼具搜伏风、消暗瘀、祛宿痰功效，临床效果更加显著[34]。

既往实验[16]已证实搜风愈喘方可降低TGF-β1 表达，抑制气道重塑。TGF-β1 是上皮间质转化最有力的诱导剂，抑制TGF-β1 的表达可抑制上皮间质转化。本次实验研究中搜风愈喘方各组血清中TGF-β1、IL-17 含量明显降低，肺组织中TGF-β1、α-SMA 和N-cadherin 基因表达明显下调，E-cadherin 基因表达明显上调，表明搜风愈喘方可通过降低TGF-β1 水平，抑制上皮间质转化，从而减轻气道重塑。

综上，搜风愈喘方可通过降低TGF-β1 水平，从而改善肺组织EMT，达到防治哮喘气道重塑的目的。本研究结果进一步证实了哮喘“伏风暗瘀宿痰”病机假说的合理性，为防治哮喘提供了线索。TGF-β1是上皮间质转化的关键诱导因子之一，可通过多种信号通路参与调节。搜风愈喘方调控上皮间质转化从而抑制气道重塑的作用具体是通过哪种信号通路实现的尚需深入研究。