猪δ冠状病毒重庆流行株的诊断与N基因序列分析

吴学婧,于吉锋,叶勇刚,肖 璐,毛从剑,曹 冶,康润敏通信作者

1.四川省畜牧科学研究院,四川 成都 610066 2.动物遗传育种四川省重点实验室,四川 成都 610066

0 引言

猪δ冠状病毒(porcine deltacoronavirus,PDCoV)又称猪丁型冠状病毒,是一种新型的致病性猪肠道冠状病毒。PDCoV可引起感染猪发生水样腹泻、呕吐及脱水[1],可引起肠绒毛萎缩、脱落,肠上皮细胞肿胀和空泡化。其临床症状和病理变化与猪流行性腹泻病毒(porcine epidemic diarrhea virus,PEDV)、传染性胃肠炎病毒(transmissible gastraenteritis virus,TGEV)、猪轮状病毒(porcine rotavirus,PoRV)等感染相似[2],在临床中难以区分。各年龄段猪均可感染PDCoV,感染猪日龄越小,死亡率越高[3]。由于免疫系统发育不全,新生仔猪感染后死亡率最高;育肥猪和母猪也会出现腹泻等典型的临床症状,但症状相对较轻,死亡率较低[2]。

PDCoV属套式病毒目(Nidovirales)、冠状病毒科(Coronaviridae)、δ 冠状病毒属,是一种具有囊膜的单股正链 RNA 病毒[4]。PDCoV基因组全长约25.4 kb,是已知冠状病毒中基因组最小的病毒[5]。基因组结构为5′端非编码区(Untranslated regions,5′UTR)—复制酶多聚蛋白(ORF1a/b)—纤突蛋白(Spike,S)—囊膜蛋白(Envelope protein,E)—膜蛋白(Membrane,M)—非结构蛋白 6(nonstructural protein 6,NS6)—核衣壳蛋白(Nucleocapsid,N)—非结构蛋白7(nonstructural protein 7,NS7)—3′端非编码区(3′UTR)[6]。S蛋白是一种跨膜蛋白,在受体识别和与宿主细胞膜的融合中发挥重要作用,可诱导机体产生中和抗体,由S1和S2亚基组成[7]。N基因编码的N蛋白是主要的结构蛋白,和病毒核酸结合组成病毒基本结构,具有高度保守性。N蛋白可诱导机体细胞发生强烈的免疫应答,产生大量的特异性抗N蛋白抗体。E蛋白和M蛋白是跨膜蛋白,参与病毒包膜的形成和释放[2]。

自2014年初PDCoV引起的仔猪腹泻在美国暴发以来,PDCoV已蔓延至全球,加拿大、泰国、越南、中国、韩国、日本等国家均有报道[8-9]。Zhang et al.[10]对2012—2018年中国南方5省腹泻样本的检测发现PDCoV样本流行率和环境检出率仅次于PEDV,且与致病性猪肠道冠状病毒(PEDV、TGEV、PoRV等)存在混合感染。近年来,PDCoV已开始在我国广泛流行,市场上尚无商品化疫苗,给养猪业造成了重大影响。此外,PDCoV具有跨物种传播风险,可感染禽类、牛等其他物种,此前还有报道显示海地3名儿童感染PDCoV,对人类公共安全存在潜在威胁[11-12]。2023年,重庆市某规模化养猪场猪群出现腹泻等症状,本研究对该猪场腹泻病例进行了临床剖检及实验室诊断,确定为PDCoV感染。对该流行毒株核蛋白(N)基因进行了序列分析,以了解该毒株的遗传进化规律,进一步掌握我国PDCoV的病原学及流行病学情况,为PDCoV的防控提供科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品来源

2023年5月,重庆市某规模化养猪场猪群发生腹泻,已接种猪传染性胃肠炎、猪流行性腹泻二联灭活疫苗(WH-1株+AJ1102株)的保育猪、育肥猪均发生腹泻,随后产房母猪及哺乳仔猪腹泻。腹泻猪群精神沉郁,排灰黑色水样稀便,脱水、消瘦,部分感染猪稀便呈喷射状排出,使用抗生素治疗无效。新生仔猪持续腹泻3～4 d,出现少量死亡,发病仔猪约286头,死亡63头,死亡率22.03%。成年猪腹泻后症状较轻,通常能自行耐过,未发生死亡。取腹泻濒死仔猪,送四川省畜牧科学研究院动物遗传育种四川省重点实验室进行腹泻相关病原检测。

1.1.2 主要试剂与仪器

FineMag磁珠法动物病毒DNA/RNA快速提取试剂盒,购自济凡生物科技(常州)有限公司;M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover反转录试剂盒、2×M5 Hiper plus Taq HiFi PCR Mix(with blue dye)均购自北京聚合美生物科技有限公司;GoldView I型核酸染色剂购自北京索莱宝科技有限公司;DNA Maker,购自北京博迈德基因技术有限公司;Biowest琼脂糖,购自北京百晶生物技术有限公司;pMD19-T载体等,购自宝生物(大连)有限公司;感受态大肠杆菌 DH5α、胶回收试剂盒,购自天根生化科技北京有限公司。

1.2 方法

1.2.1 细菌的分离培养

无菌采集腹泻濒死仔猪心血、肝脏、脾脏接种于鲜血琼脂培养基,37 ℃恒温培养24 h,观察是否有菌落形成,结果未发现菌落形成。

1.2.2 样品采集与处理

取腹泻濒死仔猪剖检观察病理变化,无菌采集仔猪小肠组织,加入无菌PBS研磨,制成1：5重量体积比的组织悬液,-80 ℃反复冻融3～5次,12 000 r/min离心10 min收集上清液,-80 ℃保存备用。

1.2.3 引物设计与合成

根据文献报道[13-14]分别合成扩增PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV基因部分片段的引物。参照GenBank中登录的PDCoV CHN/Sichuan/2019株(登录号:MK993519.1)等全基因序列,利用软件Premier premier 5.0设计扩增PDCoVN基因片段的引物(引物序列见表1),引物均由成都擎科梓熙生物技术有限公司合成。

表1 鉴定引物序列

1.2.4 病毒RT-PCR检测

按照FineMag磁珠法动物病毒DNA/RNA快速提取试剂盒说明书提取小肠组织上清液RNA,采用M5 Super plus qPCR RT kit with gDNA remover反转录试剂盒将RNA反转录为cDNA。以cDNA为模板,分别进行PEDV、TGEV、PoRV、PDCoV的RT-PCR扩增,反应体系为:2×M5 Hiper plus Taq HiFi PCR Mix 6.5 μL,cDNA 1 μL,上下游引物各1 μL,RNase-free Water补足至20 μL。PCR反应程序:94 ℃预变性3 min;94 ℃变性25 s,55 ℃退火25 s,72 ℃延伸10～30 s(延伸速度为10～15 kb/min),35个循环;72 ℃延伸5 min。反应结束后,PCR产物进行1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果。

1.2.5 PDCoV的N基因的克隆测序

提取出的cDNA为模板,PDCoV-N-F/R为引物,扩增PDCoVN基因,PCR反应体系同1.2.4。取PCR产物经1%琼脂糖凝胶电泳并观察结果。扩增的PCR产物用胶回收试剂盒纯化回收,回收产物测序鉴定。测序正确的胶回收产物连接pMD19-T载体,转化DH5α感受态细胞,筛选阳性克隆,送成都擎科梓熙生物技术有限公司进行测序。

1.2.6 PDCoVN基因序列分析

利用生物学软件DNAStar和MEGA11.0将PDCoV流行株N基因序列与GenBank中登录的30株PDCoV参考毒株N基因序列进行核苷酸序列分析和遗传进化分析。利用Mega 11.0软件进行遗传进化分析,采用邻接法(neighbor-joining)构建系统发育树,系统发育树各分枝置信度采用重抽样法(bootstrap)进行自举检验,检验次数设置为1 000次。参考毒株序列信息见表2。

表2 PEDV参考毒株

续表

2 结果

2.1 剖检病变

无菌条件下剖检腹泻濒死仔猪,可见发病仔猪小肠肠壁变薄、小肠黏膜充血、出血,肠道内充满气体和黄色液体,肠道及胃内含有未消化的凝乳块。病猪的腹股沟淋巴结及肠系膜淋巴结等出现不同程度肿胀(见图1)。

图1 小肠黏膜充血

2.2 RT-PCR检测结果

送检样品RT-PCR产物经电泳鉴定,结果显示PDCoV为阳性,扩增出长度约627 bp的目的条带,与预期大小相符。PEDV、TGEV、PoRV未扩增出条带,均为阴性(见图2)。

2.3 PDCoV N基因的克隆

以腹泻仔猪小肠组织 cDNA为模板,PDCoV-N-F/R为引物,扩增出约1 348 bp的PCR产物,与预期大小相符(见图3)。将N基因扩增产物连接转化构建质粒后测序,结果表明成功扩增出全长1 029 bp的PDCoVN基因,将该PDCoV流行毒株命名为CQ2023。

M—DNA分子量标准(BM5000+); 1—PDCoV N基因PCR产物;2—阴性对照。

2.4 PDCoV 流行株N基因核苷酸同源性分析

采用DNAStar软件将获得的PDCoV CQ2023株N基因核苷酸与30株参考毒株N基因核苷酸序列进行同源性分析,结果显示PDCoV CQ2023株与参考毒株核苷酸相似性为96.7%～99.4%(见图4),其中与CHN-HeN06-2022株的相似性最高,为99.4%,其次是CHN/Sichuan/2019株,相似性为98.9%;与HKU15-155和HKU15-44的相似性均为98.3%;与美国毒株Michigan/8977/2014、USA/Minnesota159/2014、SDCV/USA/Illinois121/2014的相似性为98.2%、98.3%、98.0%;与韩国KNU16-07株、日本OKN/JPN/2014株的相似性分别为98.2%、98.3%;与东南亚泰国P2_13_ST2_0313/PDCoV/0213/Thailand株和越南VUT-1/2016/Vietnam株的相似性为97.2%、96.7%。

图4 PDCoV流行株N基因核苷酸序列比对结果

2.5 PDCoV流行株N基因遗传进化分析

利用MEGA 11软件中的Clustal W方法将本研究毒株与30株具有代表性的国内外PDCoV参考毒株N基因核苷酸进行序列比对,并构建系统发育树(图5)。结果显示,通过PDCoVN基因遗传进化树分析,可将PDCoV分为3个相对独立的群,分别为美国/韩国/日本毒株、中国毒株及东南亚地区毒株。中国毒株与美国和韩国/日本毒株亲缘关系较近,序列相似性较高,可能起源于同一毒株;与东南亚地区毒株亲缘关系较远,序列相似性最低。在国内毒株中,PDCoV CQ2023与CHN-HeN06-2022株、CHN/Sichuan/2019株同处一个分支,亲缘关系最近,与早期国内流行毒株亲缘关系相对较远。

图5 PDCoV N基因系统进化树分析

3 讨论

冠状病毒(croronaviruses)可分为α、β、γ及δ4种不同病毒属,α-冠状病毒和β-冠状病毒主要感染哺乳动物,γ-冠状病毒通常感染鸟类,δ-可同时感染哺乳动物和鸟类。近年来,由于严重急性呼吸系统综合征冠状病毒(SARS-CoV)(2003年)、严重急性呼吸系统综合征冠状病毒2(SARS-CoV-2)(2019年)等的出现,人们对冠状病毒的关注与日俱增[15]。冠状病毒为单链 RNA病毒,可打破物种屏障,具有跨物种传播风险,对全球养猪业及相关从业人员构成威胁。猪肠道冠状病毒是病毒性腹泻中最重要的病原,主要包括PEDV、TGEV、PDCoV、猪急性腹泻综合征冠状病毒(swine acute diarrhea syndrome-coronavirus,SADS-CoV)等[16]。这些病毒具有类似的流行规律、临床表现和病理特征,可感染不同年龄的猪,导致腹泻、呕吐和脱水,但感染部位和症状严重程度有所不同[17]。PDCoV作为一种新发的猪肠道冠状病毒,对仔猪危害最严重,育肥猪和母猪感染后症状较轻,常呈隐性感染或与其他病原混合感染[18]。

自2012年首次报道以来,PDCoV已迅速在全球多个国家和地区流行,毒株的变异可能导致大流行。目前关于PDCoV临床诊断、流行病学、致病性及疫苗研制的研究较为缺乏,因此持续开展流行毒株的诊断、致病特性及基因序列分析对于PDCoV的防控和疫苗开发至关重要。本研究以2023年重庆市某规模化养猪场腹泻仔猪为材料,进行了腹泻病原的实验室诊断,探究了致病毒株PDCoV的N基因序列特征。

PDCoVN基因在不同PDCoV毒株间高度保守,N基因编码的N蛋白是构成病毒衣壳的成分,在病毒复制及致病过程中发挥着多种生物学功能,是研究PDCoV感染、复制以及免疫机制的重要基因[8]。通过比对N基因序列,发现PDCoV CQ2023株与参考毒株核苷酸相似性为97.0%～99.4%,具有较好的保守性。与CHN-HeN06-2022株的核苷酸相似性最高,亲缘关系最近,表明可能具有相同起源,因生猪跨区域调运及毒株变异等演化为不同毒株。CQ2023株与国内流行毒株处于同一进化分支上,表明CQ2023株为国内流行毒株。有研究显示PDCoV国内分离毒株在Nsp2和Nsp3区域与泰国、越南和老挝分离毒株间具有相同的不连续氨基酸缺失[19],表明毒株进化过程中可能发生了基因突变和重组。本研究对N基因核苷酸序列的遗传进化分析发现,不同流行毒株间存在区域性,国内毒株间亲缘关系较近,聚为一群,美国/日本/韩国毒株和东南亚毒株分别聚为一群,不同地区毒株间的遗传进化关系还需要进一步论证。N蛋白具有很好的抗原性,已被作为PDCoV早期诊断的重要靶标应用于PDCoV的核酸检测和免疫学诊断中,对N基因序列的研究可为PDCoV的诊断、体外表达及基因工程疫苗的开发提供参考资料。

4 结论

本研究以重庆市某规模化养猪场腹泻仔猪为材料,对其进行病原检测,结果显示为PDCoV感染。扩增该毒株N基因片段,并对其克隆测序,应用生物学软件对N基因进行序列分析。结果表明该毒株为PDCoV国内流行株,其N基因具有较好的保守性,与近年我国河南、四川等地流行毒株亲缘关系较近,以上研究丰富了我国PDCoV流行病学数据库。