同种抗-C、e 伴类同种抗-e、Jkb自身抗体的鉴定及输血治疗

邹昕 马思飞 杨红梅 范小杰

(1.江苏省常州市中心血站，江苏 常州 213000；2.江苏省常州市第一人民医院检验科)

为了提高临床输血效率，意外抗体的筛查已经作为输血前的常规检查项目。 意外抗体主要包括同种抗体和自身抗体两大类，也是引起溶血性输血反应的主要原因之一。近年来，类同种自身抗体(mimicking antibodies，简称类抗体)的报道逐渐增加，它具有明显红细胞同种抗体特异性，又能被该特异性抗原阴性的红细胞吸收[1-3]。 日常工作中吸收放散试验是准确判断抗体性质的利器，然而多系统联合多种抗体同时出现，常给输血前鉴定带来极大的困难。我们在工作中发现了1 例同时产生抗-C、e 同种抗体和抗-e、Jkb类同种自身抗体的案例，现报道如下。

1 材料与方法

1.1 患者资料

患者，女，44 岁，于2022 年12 月因贫血收入常州市某医院住院治疗，期间输血1 次(2022 年12 月12 日，抗体筛选阴性输注悬浮少白细胞红细胞1.5 U)。 2023 年5 月因异常子宫出血手术需要备血，抗体筛查试验由阴性变为阳性，送常州市中心血站输血研究室特配红细胞。

1.2 血清学检查

1.2.1 试剂与仪器

IgM 型抗-A/B、抗-C、抗-c、抗-E、抗-e、反定型红细胞、抗球蛋白试剂、酸放散试剂(上海血液生物，批号:20220101、20223001、 20223101、 20223203、 20223301、 20235316、20225001、20222102)； 抗-D ( 北京金豪制药， 批号:20220601102)；抗-Jka、抗-Jkb单克隆抗体(德国CE 公司，批号:OJkaM220-1、OJkbM136-1)；筛选细胞(匈牙利Reagens公司，批号:702307)；谱细胞(匈牙利Reagens 公司/荷兰Sanquin 公司，批号:732307、8000459230)；凝聚胺(珠海贝索生物，批号:A211203)；微柱凝胶卡(奥森多，批号:AHC290H)。 KA-2200 血型血清学专用离心机(日本久保田)；医用离心机(江苏贝索生物)；恒温水浴箱(上海跃进医疗)；血型及配血离心孵育工作组(奥森多)。

1.2.2 ABO 血型、Rh 分型和Kidd 血型的鉴定

采集EDTA 抗凝全血，采用试管法鉴定ABO、Rh 和Kidd 血型系统相关抗原。 ABO 血型正定型、Rh 分型和Kidd血型鉴定，分别加入1 滴相应的抗体试剂和1 滴洗涤过的患者3%的红细胞，1 000 g 离心15 s， 观察凝集结果。 ABO 反定型， 3 支试管分别加入2 滴患者血清和1 滴试剂盒Ac、Bc、Oc，1000 g 离心15 s， 观察凝集结果。

1.2.3 抗体鉴定试验

利用盐水法、抗球蛋白试验和凝聚胺法配合2 套谱细胞进行抗体特异性鉴定。 抗球蛋白试验包括直接抗人球蛋白试验(direct antiglobulin test， DAT) 和间接抗人球蛋白试验(indirect antiglobulin test， IAT)。 DAT:采用多抗、抗-IgG和抗-C3d 试剂，试管法室温盐水直接离心检测。 IAT:按照试剂说明书利用微柱凝胶卡法检测。

1.2.4 吸收放散试验

选择O 型Rh、Kidd 表型多种组合的献血者压积红细胞与患者血清1 ∶1于37℃孵育吸收1 h，分离上清备用，红细胞进行酸放散，放散液用试管法和微柱凝胶卡进行抗体鉴定。

1.2.5 抗体效价测定及积分评分法

等比稀释法进行抗体效价检测，用经典抗球试管法进行测定。 凝集强度的判读和分级参考AABB 技术手册(第18 版)，肉眼观察结果为1 个牢固的凝块为4＋，评12 分；若干个大凝块为3＋，评10 分；中等大小凝块，背景干净为2＋，评8 分；小凝块，背景浑浊为1＋，评5 分；凝块极小，背景浑浊为1＋w，评3 分；凝块几乎不可见，背景浑浊为±，评2 分；无凝块为0 分。

1.2.6RHCE、JKA/JKB基因测序及分析

设计匹配引物扩增RHCE基因、JKA/JKB基因。 基因组DNA 的提取、PCR 扩增及产物纯化及测序，均参照ISBT 血型相关抗原等位基因数据库进行比对分析，该试验由天津秀鹏基因技术有限公司完成。

1.2.7 交叉配血试验

前后共筛选出6 单位A 型ccDEE、Jk(a＋b-)洗涤红细胞，分别以试管法、凝聚胺、微柱凝胶法进行交叉配血试验。输注d2 监测血红蛋白(Hb)等相关指标。

2 结果

2.1 患者ABO、Rh、Kidd 血型及直抗试验(DAT)

试管法鉴定该患者血型为A 型，Rh 分型结果为ccDEE，Kidd 分型为Jk(a＋b＋)，多次离心后未见有混合凝集，见表1。

-D -C -c -E -e -IgG， C3d -IgG C3d -Jka -Jkb IS 4＋ 0 3＋ 3＋ 02＋2＋01＋1＋多次 4＋ 0 4＋ 4＋ 02＋2＋03＋1＋

2.2 抗体筛选试验

患者血清与抗体筛选细胞在盐水室温即刻离心(immediate spin， IS)中无凝集、无溶血，在凝聚胺、微柱凝胶卡中有凝集，提示该患者血清中含有不规则抗体，需进一步抗体特异性鉴定。

2.3 抗体特异性鉴定试验

将患者血清与2 套谱细胞反应，结果见表2～3。 患者血清与谱细胞在微柱凝胶卡中均出现不同强度的凝集，符合抗-e 和抗-Jkb格局。 但不排除抗-C、抗-f。 患者直抗呈弱阳性，继而对患者自身红细胞进行酸放散，放散液抗体鉴定检出抗体，符合抗-e 和抗-Jkb格局，见表3。

2.4 多重吸收放散鉴定抗体特异性

将患者血清分别用O 型R2R2献血者压积红细胞1 号[ccDEE、Jk(a＋b-)]、2 号[ccDEE、Jk(a-b＋)]吸收，将吸收后的红细胞进行洗涤，直至洗涤液抗筛结果为阴性，再把1、2 号细胞进行酸放散试验，红细胞放散液与谱细胞在盐水介质中呈阴性反应，吸收后的上清和红细胞放散液与谱细胞反应，在微柱凝胶卡中结果如表4。 可以证实吸收后的上清仍能检出抗-e 特异性，放散液中同样也有抗-e 和抗-Jkb，这是类抗体的特性，因此该患者血清中存在类抗-e 和类抗-Jkb。 用2 号吸收过的上清液分2 份继续进行2 次吸收，1 份用O 型rr 献血者压积红细胞3 号(ccdee)，吸收后的上清液鉴定出抗-C，基本排除抗-Ce，同时放散液中检出抗-e 特异性。 1 份用O 型R1R1献血者压积红细胞4 号(CCDee)，吸收后的上清液未检出抗体，排除抗-f，而放散液检出抗-e(不排除抗-C)特异性见表4。

Rh-hr D C Ece Cw K k M N Ss P1 Lea Leb Fya Fyb Jka Jkb Dia Kpa Kpb Lua Lub IS IAT Poly 1 R1R1K＋ ＋＋00＋0＋0＋00＋＋0＋＋＋0＋00＋0＋0 4＋ 4＋2 R2R2＋0＋＋000＋＋＋＋＋00＋0＋＋＋＋0＋0＋0 1＋ 2＋3r’r0＋0＋＋00＋0＋0＋＋0＋0＋＋000＋0＋0 4＋ 4＋4r′′r00＋＋＋00＋＋＋0＋＋0＋＋0＋000＋0＋0 4＋ 4＋5 rrK＋000＋＋0＋＋＋0＋0＋000＋0＋00＋0＋0 4＋ 4＋6R0r＋00＋＋00＋＋＋0＋＋0＋＋00＋0＋＋0＋0 4＋ 4＋7 R1R1 W ＋＋00＋＋0＋0＋＋＋＋0＋＋＋＋000＋0＋0 4＋ 4＋8rr000＋＋00＋0＋0＋00＋0＋＋＋0＋＋0＋0 4＋ 4＋9 R1R2＋＋＋＋＋0＋＋＋0＋＋0＋0＋0＋＋00＋0＋0 4＋ 4＋10 R1R1＋＋00＋00＋＋＋＋0＋000＋＋000＋＋＋0 4＋ 4＋11rr000＋＋00＋＋＋0＋＋＋0＋0＋000＋0＋0 4＋ 4＋自身0 2＋ 2＋

2.5 抗体效价积分鉴定

为了验证患者血清中是否存在同种抗-e，用红细胞(ccDEE)4 次吸收血浆中的抗体；同时用已知抗-E 做阳性对照吸收，见图1。 测定多次红细胞吸收前后血清中抗体效价。 原血清抗-e 效价为16，评分为46 分；4 次吸收后血清抗-e 效价为8，评分为40 分，患者效价结果没有明显的变化，而平行阳性对照效价从16 降为1，积分从47 下降至2，抗体在吸收放散时会有部分稀释作用导致效价及评分下降，该试验证明患者血清中存在未能被红细胞(ccDEE)吸收的同种抗-e。

图1 抗-e 多次吸收前后抗体效价及积分鉴定Figure 1 The titer and integral of anti-e before and after multiple absorption

2.6 RHCE 和JK 基因型分析

RHCE基因采用直接测序法测定1～10 外显子，RHCE∗01 相比， 第5 外显子676 位出现G＞C，其余外显子没有发生突变，由此可以判断RHCE血型基因型为cE/cE纯合，其表型为ccEE 型。JK基因中第9 外显子838 位是JKA与JKB等位基因的区分位点，采用测序法仅检测该突变点位置。 以JK∗01 为参考序列发现838G/ A 杂合，由此可以判断其表型为JK(a＋b＋)型，见图2～3。

图2 RHCE 基因测序结果Figure 2 The results of genetic sequencing for RHCE gene

图3 JK 基因测序结果Figure 3 The results of genetic sequencing for JK gene

2.7 输血效果

3 讨论

在同种抗体和自身抗体之间还存在1 种类同种抗体，可以有同种抗体的性质，选择性地针对相应红细胞上的血型抗原，又有自身抗体的特性，具有针对自身红细胞血型抗原[4]。 类抗体的出现与红细胞上是否有相应抗原没有必然联系，一般是由于直接抗人球蛋白试验阳性，放散后发现与红细胞上抗原不符；或者血清中抗体与红细胞上抗原相互矛盾而发现的。 因此当怀疑有类抗体时，可能需要较多试验来鉴定抗体的性质及血清学特征。 目前血清学、分子生物学联合应用于辅助诊断未知抗体的产生，该技术的发展提高了临床输血的安全性[5-7]。 然而吸收放散试验是区分类同种抗体和同种抗体的利器，多次吸收放散可鉴别区分多重混合抗体。 在不改变抗体性质的前提下促使血清抗体与红细胞抗原可逆性结合，通过改变物理条件，血清抗体可从红细胞中脱落，再利用已知抗原红细胞进行鉴别，继而达到吸收、放散过程[8-10]。

本患者有输血史，产生同种抗体的可能性极大，经毛细管分离试验排除输血反应。 通过血清抗体特异性鉴定发现其血清中除抗-e、抗-Jkb之外还有易漏检的抗-C 以及抗-f，而放散液检出抗-e 及抗-Jkb。 因与患者ccDEE 、Jk(a＋b＋)分型有矛盾，提示有类抗-e 和类抗-Jkb。 利用红细胞1 号[ccDEE、Jk(b-)]、2 号[ccDEE、Jk(b＋)]、3 号(ccdee)吸收放散，吸收后的上清液都没有抗-Jkb，且能在放散液中检出抗-Jkb，证实患者血清里存在类抗-Jkb，同时也检出类抗-e、抗-C，排除抗-f，但是不排除同种抗-e。 利用红细胞(ccDEE)多次吸收患者血清，检测吸收前后的抗-e 效价，结果抗体效价和评分均未明显改变，血清多次吸收后仍存在抗-e 格局抗体，而平行阳性对照抗-E 吸收后积分及效价直线下降，而红细胞(ccdee)吸收后血清中未见抗-e，说明患者体内存在同种抗-e。

大多数情况下， 由于机体存在免疫监视、免疫自稳和免疫耐受的原因， 患者体内不会自发产生同种抗体和自身抗体[11-12]，然而输血过程中患者容易发生各种不良反应，输血免疫反应、基因突变或者药物都会影响检测结果，通过分子生物学技术对JK和RH基因型的精准分析，结果显示该患者JK基因中第9 外显子838G/ A 杂合[13]，由此可以判断其表型为Jk(a ＋b ＋)型；RH基因型是DcE/DcE，其表型为ccDEE。 这些结果基本排除由于体内细胞基因突变导致产生类抗体而逃避自身免疫监视，但RHCE基因以及JK基因的转录翻译以及抗原的完整性是否有影响还有待进一步研究。 有关类抗体产生的原因目前仍需大量试验研究，有报道指出单独药物所致占比最多，可达48%左右[14]，涉及抗肿瘤、抗生素、抗病毒以及抗炎药等多种药物，可能是与药物相关的免疫机制生化修饰作用所致[15]。 该患者最近半年服用补血类中药制剂等药物，结合病史高度怀疑患者因使用多种药物导致产生自身类抗体。

区分同种和类同种抗体的目的在于输血研究，对于存在类抗体的患者，输血时我们应考虑多方面问题，是选择与患者同型，还是避开类抗体。 部分研究者认为对于产生类抗体的贫血患者如病情允许，应避免输血为宜，如必须要输血治疗，可以选择暂时避开类抗体特异性输血，若寻找类抗体对应抗原阴性的红细胞太困难，可考虑忽略类抗体，采取最小不相容输注策略，但是要注意是否发生迟发性溶血反应，关注患者输血后Hb[16]。 2023 年本实验室检出的另3 例类抗体标本，我们运用红细胞同型和非同型在体外溶血试验配血[17]，发现避开类抗体的相容性试验，溶血时间明显延后，患者输血后效果良好，说明在输血时如果可以尽量避免类抗体以及增加体外溶血试验配血。

综上所述，该患者在半年之内产生了抗-C、e 同种抗体伴随抗-e、Jkb类同种自身抗体。 血清学结合分子生物学对患者红细胞表型鉴定，以及吸收放散试验和效价积分法对患者血清、红细胞进行抗体特异性检测，综合分析可区分出同种抗体或类同种抗体，选择相应抗原阴性的血液进行输注，为精准输血做好保障。