PD-L1/PD-L2对食管鳞癌细胞恶性表型的影响及耐药研究

梁 艳, 郑树涛, 和 硕, 谭依依, 彭天元, 卢晓梅

(1新疆医科大学基础医学院病理学教研室, 乌鲁木齐 830017; 2新疆医科大学第一附属医院临床医学研究院,省部共建中亚高发病成因与防治国家重点实验室, 乌鲁木齐 830011)

食管癌(Esophageal cancer,EC)作为常见的消化道恶性肿瘤之一[1],组织病理分型以食管鳞癌最为多见,由于其发病早期较为隐匿,致使多数患者错过最佳手术治疗时期,极大降低了患者的生存率,影响患者总体预后情况。因此,探寻新型有效的食管癌治疗方案具有重大意义[2]。

程序性死亡配体1(Programmed cell death 1 ligand 1,PD-L1)是免疫检查点分子-程序性死亡蛋白1(Programmed cell death 1,PD-1)的配体,与程序性死亡配体2(PD-L2,又称CD273)同属于B7家族蛋白成员[3]。研究发现,PD-L1在许多恶性肿瘤中呈高表达且具有一定的临床意义,在肿瘤的发生发展、侵袭和转移过程中发挥关键作用,且能促使肿瘤发生逃逸,通常与较差的预后相关[4-5]。而PD-L2也被发现可与PD-1结合后发挥抑制免疫细胞功能的作用[6],促进细胞恶性表型的发生[7]。本研究探讨PD-L1/PD-L2对食管鳞癌细胞增殖、迁移和侵袭以及对化疗药物敏感性的影响,现报道如下。

1 材料与方法

1.1 实验材料及主要试剂本研究所用的人食管鳞癌细胞系KYSE150购自中国科学院;BCA试剂盒(Thermo美国);RPMI1640培养基(Hyclon美国),0.25%胰蛋白酶(Gibco美国);青霉素-链霉素(Hyclon美国);胎牛血清(FBS)(Zeta life美国);CO2培养箱(Thermo美国);PD-L2过表达慢病毒委托汉恒公司完成;RNA提取试剂盒(Takara,Tokyo,Japan);PD-L1(#66248-1-Ig,Proteintech公司);PD-L2(#18251-1-AP,Proteintech公司)、β-actin(#20536-1-AP,Proteintech公司)。

1.2 细胞培养及分组使用RPMI1640培养基(含10%胎牛血清,1%青霉素/链霉素双抗),在37℃、5% CO2条件下培养人食管鳞癌细胞系KYSE150,分别构建PD-L1杂合子敲除细胞系,慢病毒转染PD-L2过表达,将细胞分为WT组(野生型PD-L1)和PD-L1+/-组(杂合子敲除PD-L1)、Ctrl组(对照)和OE-PD-L2组(过表达PD-L2),当细胞处于对数生长期时进行后续实验。

1.3 细胞转染在细胞转染慢病毒前一天需接种约5×105个细胞/孔于6孔板中,分为Ctrl组和OE-PD-L2组。当6孔板中细胞融合至40%～50%时进行慢病毒转染。转染时细胞换液用不含血清的RPMI1640培养基,对应加入病毒混合物,16～24 h后更换含10%胎牛血清(FBS),1%双抗的RPMI1640培养基,于培养箱中继续培养。转染后48 h通过荧光显微镜观察荧光强度。待6孔板中转染后的细胞长满时,将其移至25 cm2培养瓶继续培养,并通过加嘌呤霉素来筛选转染细胞。

1.4 RT-qPCR从WT组和PD-L1+/-组、Ctrl组和OE-PD-L2组细胞中提取总RNA,逆转录为cDNA,使用SYBR Green RT-qPCR试剂盒和PD-L1、PD-L2特异性引物进行RT-qPCR反应,具体引物序列见表1。18S为内参基因,通过2-△△Ct法计算PD-L1、PD-L2基因的mRNA相对表达水平。

表1 RT-qPCR检测所用引物序列

1.5 Western Blot收集细胞沉淀于EP管中,加入适量RIPA裂解液反复吹打混匀,冰上裂解30 min,12 000 r/min离心15 min,去上清,即细胞总蛋白,BCA蛋白定量试剂盒测定总蛋白质浓度以计算上样体积。配制SDS-聚丙烯酰胺凝胶,各组分别按50 μg蛋白样品等质量上样,通过电泳(恒压120 V,时间75 min)对蛋白质进行分离,随后电转(恒流300 mA,时间为2 h)至PVDF膜上,TBST洗3遍,5%脱脂牛奶封闭1 h后加入 PD-L1、PD-L2、β-actin抗体(一抗稀释比例均为1∶1 000),4℃孵育过夜,次日根据一抗种属类型加入相对应辣根过氧化物酶标记山羊抗鼠和抗兔二抗(二抗稀释比例均为1∶5 000),室温孵育1 h,ECL化学发光液显影,E-BLOT化学发光成像仪拍照,Image J软件对图像条带灰度值进行定量分析。

1.6 EdU实验用完全培养基制备细胞悬液,将细胞接种于24孔板内,每孔接种细胞量约为3×104个细胞,于37℃、5%CO2细胞培养箱中培养过夜等待细胞贴壁。用完全培养基稀释EdU至10 μmol/L,每孔加入300 μL EdU工作液,37℃孵育5 h,孵育结束后弃掉细胞培养基,4%多聚甲醛室温固定细胞15 min,含3%BSA的PBS洗涤3次,5 min/次。加入通透液(0.3% TritonX-100的PBS)在室温下孵育10～15 min。按照说明配制反应液(现用现配),每孔加入200 μL反应液,使其充分均匀覆盖细胞,室温避光孵育30 min。去除反应液,用洗涤液洗涤3次,每次5 min。Hoechst33342反应液原液需用去离子水稀释20倍,每孔加入500 μL稀释后的Hoechst33342,室温避光孵育30 min。去除Hoechst33342,用含3%BSA的PBS洗涤3次,每次5 min。荧光显微镜观察细胞EdU及DAPI染色情况,并拍照计数。

1.7 克隆形成实验取对数期生长的细胞消化,制备细胞悬液,每孔接种100个细胞于6孔板,37℃、5%CO2细胞培养箱中培养14 d左右,弃除培养基,PBS洗涤细胞3次,4%多聚甲醛固定细胞20 min,0.1%结晶紫染液染色5～10 min,PBS洗涤细胞,晾干拍照、计数。

1.8 Transwell实验用RPMI1640培养基将基质胶以1∶8的比例稀释,加入Transwell上室中,随后放入37℃、5% CO2培养箱中孵育4～6 h。吸掉上室中多余液体,加入无血清培养基放回培养箱中基底膜水化30 min。取WT组和PD-L1+/-组、Ctrl组和OE-PD-L2组细胞,用无血清培养基制成细胞悬液,接种至铺好基质胶的上室中以观察细胞的侵袭能力,另将细胞接种至未铺基质胶的上室中检测细胞的迁移能力,下室加入含10%FBS的完全培养基,于37℃、5% CO2孵箱中培养24 h后,弃掉小室内培养基,用棉签轻轻擦拭上层小室内表面的细胞。4%多聚甲醛室温避光固定30 min,室温下自然晾干,0.1%结晶紫染液染色15 min,显微镜下观察并拍照,随机选取3～5个视野进行计数,并统计结果。

1.9 CCK-8法检测化疗药物对细胞活力的影响取WT组和PD-L1+/-组细胞、Ctrl组和OE-PD-L2组细胞消化,用完全培养基重悬,接种于96孔板,孵箱培养4～6 h待细胞贴壁后,吸出培养基,更换为提前配制的顺铂(Cisplatin,CDDP)药物浓度为0、20、40 μmol/L,五氟尿嘧啶(5-FU)药物浓度为0、5、10、20 μmol/L的完全培养基,每孔加入100 μL,培养48 h后,加入CCK-8试剂,37℃、5% CO2培养箱中避光孵育2 h,酶标仪检测450 nm处吸光度OD值。计算公式:细胞活力=(OD_加药组-OD_空白对照组)/(OD_对照组-OD_空白对照组)×100%。本研究所用的化疗药物浓度梯度设计是根据查阅相关文献[8-9]所得,结合细胞自身对药物反应状态作相应调整。

1.10 蛋白质芯片筛选差异表达蛋白比较WT组和PD-L1+/-组的蛋白质芯片上的蛋白表达量,以两组表达差异倍数(Fold change,FC)>1.2或<0.83(log FC>0.263)的差异表达蛋白和P<0.05为阈值,筛选WT组和PD-L1+/-组细胞之间特异性表达差异的蛋白质,可作为相关蛋白质生物标志物。

1.11 生物信息学分析根据筛选的差异表达蛋白,制作散点图,作图函数为ggplot2,数据包为ggfortify。横、纵坐标分别代表每个分组的平均表达量AveExp(每个样本数值取对数后的平均值),红色表示上调蛋白,蓝色表示下调蛋白,灰色表示差异不明显。采用Fisher精确检验法,利用R/Bioconductor数据包clusterProfiler进行基因本体(Gene ontology,GO)功能富集(GO分析挑选的标准是落在某个term/GO上差异的基因数目≥5,P<0.05)和京都基因与基因组百科全书(Kyoto encyclopedia of genes and genomes,KEGG)信号通路富集分析。

2 结果

2.1 杂合子敲除PD-L1和过表达PD-L2对食管鳞癌细胞增殖能力的影响通过RT-qPCR、Western Blot验证杂合子敲除PD-L1的效果,结果显示,与WT组(野生型PD-L1)相比,PD-L1+/-组(杂合子敲除PD-L1)的PD-L1 mRNA水平和蛋白表达均显著降低,差异具有统计学意义(P均<0.05),见图1A、1B。在食管鳞癌KYSE150细胞中转染Ctrl和OE-PD-L2慢病毒后,采用RT-qPCR、Western Blot验证PD-L2过表达慢病毒转染效果,结果显示,与Ctrl组(对照)相比,OE-PD-L2组(过表达PD-L2)中的PD-L2 mRNA水平和蛋白表达均明显增加,差异具有统计学意义(P均<0.05),见图1C、1D。

注： A和C, RT-qPCR检测PD-L1,PD-L2在mRNA水平上的表达; B和D, Western Blot检测PD-L1, PD-L2在蛋白水平上的表达; *P<0.05, **P<0.01, ****P<0.000 1。

用EdU法和克隆形成实验方法检测杂合子敲除PD-L1和过表达PD-L2对食管鳞癌细胞增殖能力的影响,结果显示,与WT组相比,PD-L1+/-组EdU阳性细胞百分比和细胞克隆数量均显著降低,差异具有统计学意义(P<0.001),表明杂合子敲除PD-L1可降低食管鳞癌细胞的增殖能力。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组EdU阳性细胞百分比和细胞克隆数量均显著增加,差异具有统计学意义(P<0.05),表明过表达PD-L2可增加食管鳞癌细胞的增殖能力,见图2A、2B。

注: *P<0.05, ***P<0.001。

2.2 杂合子敲除PD-L1和过表达PD-L2对食管鳞癌细胞迁移、侵袭能力的影响Transwell实验评估杂合子敲除PD-L1和PD-L2过表达对食管鳞癌细胞迁移、侵袭能力的影响,结果显示,与WT组相比,PD-L1+/-组KYSE150细胞的迁移(P<0.01)、侵袭能力(P<0.05)明显降低,差异具有统计学意义,表明杂合子敲除PD-L1可降低食管鳞癌细胞的迁移侵袭的能力。与Ctrl组相比,OE-PD-L2组KYSE150细胞的迁移能力增加,差异有统计学意义(P<0.05),而细胞侵袭能力无明显变化,可见PD-L2过表达可增加食管鳞癌细胞的迁移能力,而对细胞侵袭能力无明显影响,见图3。

注: *P<0.05, **P<0.01。

2.3 在食管鳞癌细胞中杂合子敲除PD-L1和过表达PD-L2对化疗药物敏感性的影响在顺铂药物梯度浓度干预下,与WT组相比,PD-L1+/-组细胞增殖活力明显下降,差异有统计学意义(P<0.05),表明在食管鳞癌细胞中杂合子敲除PD-L1可增加细胞对顺铂化疗药物敏感性(图4A)。在五氟尿嘧啶不同浓度梯度作用下,与WT组相比,PD-L1+/-组细胞增殖活力显著升高,差异有统计学意义(P<0.05),可见杂合子敲除PD-L1后可降低细胞对五氟尿嘧啶化疗药物的敏感性而导致细胞耐药(图4B)。

注:**P<0.01, ***P<0.001。

当顺铂药物浓度为20 μmol/L时,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力无明显变化(P>0.05),而在40 μmol/L的顺铂药物浓度作用下,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著上升,差异有统计学意义(P<0.001),提示过表达PD-L2可能降低细胞对顺铂化疗药物敏感性(图4C)。加入不同浓度五氟尿嘧啶后发现,与Ctrl组相比,OE-PD-L2组细胞增殖活力显著下降,表明在食管鳞癌细胞中过表达PD-L2可增加细胞对五氟尿嘧啶化疗药物敏感性(图4D)。

2.4 WT组与PD-L1+/-组的差异蛋白及富集分析以FC>1.2或<0.83(logFC>0.263)为阈值,通过比较WT组与PD-L1+/-组特异性表达差异的蛋白,共获得25个差异表达蛋白质,包括7个下调和18个上调蛋白,其中差异倍数最为显著的上调蛋白为EGFR(Ser1070),下调蛋白为Smad4(图5A)。对以上25个差异表达蛋白进行GO和KEGG富集分析,结果显示,BP中前3条分别是转化生长因子β受体信号通路、TOR signaling、SMAD蛋白信号转导通路(图5B)。CC中前3条分别为转录调节因子复合物、SMAD蛋白复合物、RNA聚合酶II转录调节因子复合物介导的信号通路(图5C)。MF中前3条分别是泛素蛋白连接酶结合、泛素样蛋白连接酶结合、Ⅰ型血管紧张素受体结合通路(图5D)。KEGG富集的通路前3条分别是弓形体病、Toll样受体信号通路、TNF信号通路(图5E)。

图5 KYSE150细胞中杂合子敲除PD-L1组和野生型PD-L1组的差异蛋白散点图及富集分析结果

3 讨论

临床上关于食管癌的治疗方案具有一定的局限性,随着肿瘤免疫治疗的发展,有效助力于食管癌的精准化治疗,改善食管癌患者的预后。PD-L1、PD-L2均为PD-1的配体,当其在肿瘤细胞处于高表达状态时,通过与T细胞表面PD-1蛋白相结合,诱导T细胞失活,促使肿瘤细胞发生免疫逃逸,促进肿瘤的发生发展[10-11]。虽然已对PD-1的主要配体PD-L1的临床意义进行了诸多研究,但对其另一重要配体PD-L2的作用关注较少。因此本研究实验设计旨在探讨同属于B7家族蛋白成员的PD-L1和PD-L2对食管鳞癌细胞恶性表型及耐药的影响,为治疗食管癌提供新的潜在靶标。

研究表明PD-L1在许多肿瘤细胞中可促进细胞恶性表型的发生,如结直肠癌、下咽鳞状细胞癌、头颈部癌等[12-15]。在结直肠癌和头颈部癌中,PD-L1通过调控基质金属蛋白酶促使细胞外基质降解而促进肿瘤细胞发生迁移和侵袭[12-13]。在下咽鳞状细胞癌相关研究中发现,PD-L1通过调节上皮细胞-间充质转化相关转录因子促使肿瘤细胞转移[14]。在胃癌中发现,通过Hedgehog信号转导诱导PD-L1表达促进肿瘤细胞增殖[16]。在卵巢癌中,PD-L1可通过激活血管表皮生长因子信号通路调节肿瘤血管生成以促进其恶性表型的发生[17]。PD-L2在人宫颈鳞癌组织呈高表达,且与肿瘤浸润转移相关。目前有关PD-L1、PD-L2在食管鳞癌中的研究较少,马丽莉等[18]通过免疫组织化学技术检测发现PD-L1、PD-L2在食管鳞癌组织中高表达,且与ESCC浸润转移密切相关。本研究结果显示,PD-L1、PD-L2可促进食管鳞癌细胞恶性表型的发生,与以上研究报道结果相一致,可见PD-L1、PD-L2是影响食管癌恶性表型的关键分子,在肿瘤的发生发展中起重要作用。

Inoue等[19]的研究表明抑制PD-L1和PD-L2的表达可以改善肿瘤细胞对顺铂化疗药物的反应。本研究结果显示,PD-L1、PD-L2可降低KYSE150细胞对顺铂化疗药物的敏感性,与上述研究结果一致。而在肝细胞癌及胃癌5-FU耐药研究中,通过构建PD-L1过表达及干扰耐药细胞,证实PD-L1表达干扰则可增强SGC7901/5-FU及BEL-7402/5-FU细胞对5-FU的敏感性[20]。本研究结果显示,杂合子敲除PD-L1后KYSE150细胞对5-FU的敏感性降低,与上述研究结果不一致,其原因可能是不同癌症中肿瘤细胞的异质性以及构建细胞系的模型不同,致使对药物敏感性的反应也有所不同。

表皮生长因子受体(Epidermal growth factor receptor,EGFR或HER1)主要参与细胞增殖、分化等生理过程。研究表明,EGFR在多种恶性肿瘤(如非小细胞肺癌、结直肠癌、宫颈癌、鼻咽癌等)中发生突变或存在异常表达,与恶性肿瘤的发生发展密切相关[21-24]。Smad4蛋白是转化生长因子(Transforming growth factor-β,TGF-β)家族受体下游重要胞浆内的信号转导分子,在细胞核中发挥协同作用,调节激活特定基因的转录。研究报道,Smad4失活突变或功能缺失可促使TGF-β通路的异常激活,进而使MAPK/JNK信号通路过度激活而导致抗EGFR药物治疗的耐药[25-26]。在结直肠癌中发现,Smad4突变可通过激活AKT信号通路促使结直肠癌的发生发展并且诱导其对化疗药物5FU产生耐药[27]。在胰腺癌研究报道中,Smad4缺失与胰腺癌肿瘤免疫原性差以及PD-L1表达降低有关[28]。本研究结果显示,PD-L1杂合子敲除可影响Smad4和EGFR(Ser1070)蛋白表达变化,而引起TGF-β信号通路或SMAD蛋白信号转导等信号通路的活化或抑制,上述研究报道可为此提供一定的理论依据,然而具体功能及分子机制还有待深入研究。

综上所述,本研究在体外细胞系水平探讨了PD-L1、PD-L2对食管癌细胞恶性表型及耐药性的影响,揭示了PD-L1、PD-L2在免疫治疗中是治疗食管癌的潜在靶标,为食管癌患者临床用药筛选和评估提供了一定的理论依据。但不足之处在于仅在体外单一细胞系KYSE150中探讨PD-L1、PD-L2对肿瘤细胞恶性表型影响,而尚未在体内动物水平以及临床组织中进行验证,具有一定的局限性,本研究结果可为进一步探讨食管癌侵袭转移机制和更好地改善患者预后提供新方向。