海马过表达Ephrin-B3对颞叶癫痫大鼠突触重塑的影响

李莉莉 刘田田 张 敏 刘恒方

1）郑州大学第五附属医院，河南 郑州 450015 2）郑州大学第一附属医院，河南 郑州 450052

颞叶癫痫（temporal lobe epilepsy，TLE）是一种中枢神经系统常见病，其发病机制非常复杂，既往研究表明兴奋和抑制失衡是其主要致病因素［1］，而兴奋和抑制失衡常常会引起神经元的异常放电，导致癫痫的发作［2-5］。TLE 主要病变部位在海马［6］，海马中发生神经元的丢失及新生突触重塑形成的异常神经环路是癫痫患者发生自发性痫性发作的病理基础［7］，离子型通道在神经元的异常放电中起着关键作用，参与到神经元突触的可塑性调节中［8-10］，是既往主要的研究方向。酪氨酸蛋白激酶B3（Ephrin-B3）是一种蛋白质，在神经系统中属于轴突导向蛋白［11］，在海马中广泛分布，近年来发现B3（Ephrin-B3）具有抗癫痫作用［12-13］，其可能参与到神经元之间的突触连接和突触可塑性的调节，然而，Ephrin-B3是如何参与到颞叶癫痫的发病方式目前尚不清楚。研究显示，Ephrin-B3可与离子型受体NMDA亚单位NR2B形成复合体参与到突触的长时程增强中［14］。另有研究发现，致痫后急性期海马PSD95/NR2B 表达下调，提示突触后密度蛋白95（postsynaptic density protein 95，PSD95），以及离子型谷氨酸受体亚基NMDAR2B（N-methyl-D-aspartate receptor subunit 2B，NR2B）可能参与到癫痫的可塑性调节中，基于此推测Ephrin-B3可能与突触后蛋白PSD95和NMDA有关［15］。本研究采用慢病毒过表达Ephrin-B3 对实验大鼠海马基因进行干预，旨在探讨Ephrin-B3在颞叶癫痫模型中过表达对突触相关蛋白表达的影响，探究其在癫痫的发病机制中所起的作用。

1 材料与方法

1.1 实验动物、主要仪器及试剂选用健康SPF 级雄性Sprague-Dawley（SD）大鼠，6～8 周龄，体质量200～250 g，购自辽宁长生生物技术有限公司，饲养于郑州大学第五附属医院中心实验室动物房［许可证号：SCXK（辽）2020-0001］，保持每笼大鼠3 只，给予充分的水和饲料，定期更换垫料，大鼠可以自由进行摄食、饮水。动物房内12 h昼夜节律，室温（24±2）℃。

1.2 主要仪器及试剂主要仪器：大鼠脑立体定位仪（深圳瑞沃德公司），实时荧光定量PCR仪（上海罗氏），电泳及转膜设备（美国BIO-RAD公司），Western blot化学发光成像系统（美国BIO-RAD公司）。

主要试剂：特异性引物（上海生工）、鼠β-actin抗体（武汉Proteintech公司）、鼠Ephrin-B3抗体（美国Santa Cruz）、兔NMDAR2B抗体（美国Abcam 公司）、PSD95（美国affinity公司）、氯化锂（美国Sigma-Aldrich公司）、匹罗卡品（上海麦克林）、Efnb3慢病毒（上海吉玛）。

1.3 分组将实验大鼠随机分为空白对照组、癫痫组、空载体组、慢病毒转染组共40只，每组10只。空白组不做任何处理，饲养条件同其他各组大鼠。造模以Racine 评分标准达到Ⅳ级及以上，并且持续时间超过30 min 者归为癫痫组，空载体组于两侧海马区各注射5 μL 的LV5-NC，慢病毒组于两侧海马区各注射5 μL 的Efnb3病毒，其中空载体和慢病毒注射组于1周后进行癫痫造模处理，同样达到Ⅳ～Ⅴ级者再归于空载体组和慢病毒组。

1.4 颞叶癫痫大鼠的动物模型建立采用氯化锂-匹罗卡品注射法进行颞叶癫痫的造模方法［16］，在空载体组和慢病毒组海马注射1 周后开始进行癫痫造模处理，腹腔内给予127 mg/kg 氯化锂注射，18～20 h后3组腹腔注射35 mg/kg的匹罗卡品，行为学观察按照Racine分级标准进行，达到Racine分级Ⅳ～Ⅴ级且持续时间超过30 min视为癫痫造模成功组。未达到Ⅳ级及以上者需再次注射，继续观察，直至达到致痫成功组。癫痫持续60 min后向大鼠腹腔内注入10%水合氯醛3 mL/kg 终止发作，麻醉30 min 后，各组大鼠分别于腹腔内给予生理盐水和10%的蔗糖溶液补充电解质及能量。

1.5 慢病毒的注射用10%的水合氯醛麻醉大鼠，固定于脑立体定位仪上，暴露头骨，以前囟为原点，向下3.5 mm，左右旁开1.8 mm为双侧海马位置，标记位置，用颅骨钻于标记点高速钻孔，待出现落空感时停止钻孔，使用1 μL体积的微量注射器抽取5 μL 的Efnb3 慢病毒，连接微量注射泵，两侧海马各注射5 μL，滴度为1×109TU/mL。以0.25 μL/min 速度注射，注射所需时间20 min，注射后留针10 min，缓慢拔针，骨蜡封闭。

1.6 荧光定量PCR按说明书继续操作，提取海马组织RNA，逆转录为cDNA，按照说明书加样，避光处理，放入实时荧光定量PCR 仪中检测脑组织Ephrin-B3、PSD95、NMDAR2B mRNA 的表达水平。相关检测引物序列见表1。

1.7 Western blot 检测按说明书提取海马组织蛋白，SDS-PAGE 100 V 恒压电泳约1 h，待蛋白样品电泳至胶底部时停止电泳，电流调至400 mA 转膜50 min。转膜成功后，5%的脱脂牛奶封闭1～2 h，一抗4 度过夜，二抗孵育1 h，洗膜3 遍各5 min 后，滴加ECL 显色试剂并曝光拍照保存。

1.8 统计学分析采用GraphPad Prism 8.0，Adobe Photoshop进行作图及统计学分析，计量资料以均数±标准差（±s）表示。进行正态性及方差齐性检验后，组间比较选用单因素方差分析，P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 体质量变化比较癫痫组和空载体组体质量分别为（199±32.48）g、（193.2±22.74）g，与对照组的（236.8±14.62）g 相比明显下降，慢病毒转染组体质量为（213.4±20.38）g，较癫痫模型组和空载体组体质量略有上升，转染组较癫痫组（P=0.659 8），与空载体组比较差异无统计学意义（P=0.453 1）。

2.2 癫痫发作潜伏期比较Ephrin-B3 慢病毒过表达组与癫痫模型组相比SE发作潜伏期有所延迟，差异有统计学意义（F=5.898，P=0.047 1），与空载体组相比，潜伏期略有延长，有统计学差异（P=0.019 8）。见表2。

表2 各组大鼠首次惊厥发作潜伏时间比较 （min，±s）Table 2 Comparison of latency timeof the first convulsive attack of rats in each group （min，±s）

表2 各组大鼠首次惊厥发作潜伏时间比较 （min，±s）Table 2 Comparison of latency timeof the first convulsive attack of rats in each group （min，±s）

注：与癫痫组相比，*P＜0.05，与空载体组比较，#P＜0.05。

组别癫痫组空载体组慢病毒组造模SE发作潜伏期22.4±3.91 21.0±5.29 30.2±4.38*#n555

2.3 荧光定量PCR 检测大鼠海马组织转染Ephrin-B3 mRNA表达与对照组Ephrin-B3 mRNA相对表达量（1.022±0.24）相比，空载体组Ephrin-B3 mRNA 相对表达量（0.199±0.04）和模型组Ephrin-B3 mRNA 相对表达量（0.195±0.07）显著降低（F=25.11，P＜0.000 1）；模型组与空载体组相比差异无统计学意义（P＞0.99），表明手术及载体的注入对实验未构成影响，可进行单因素的分析；Ephrin-B3 过表达组Ephrin-B3 mRNA 相对表达量（0.706±0.27）与对照组相比无统计学差异（P=0.059 4），与癫痫模型组相比表达水平有统计学差异（P=0.002 7），与空载体组相比差异有统计学意义（P=0.002 9），说明慢病毒转染成功，可进行后续实验分析处理。见图1、图2。

图1 各组不同处理后Ephrin-B3的mRNA表达水平Figure 1 The mRNA expression level of Ephrin-B3 after different treatments in each group

图2 Ephrin-B3、PSD95、NR2B、GAPDH的溶解曲线Figure 2 Dissolution curves of Ephrin-B3, PSD95, NR2B and GAPDH

2.4 荧光定量PCR 检测突触受体相关蛋白的mRNA 表达水平慢病毒Ephrin-B3 过表达检测成功后，检测各组突触相关因子PSD95、NR2B 的mRNA 表达变化，Ephrin-B3 过表达组的NR2B mRNA 相对表达水平（1.00±0.06）与模型组相对表达量（0.53±0.07）相比有显著变化（F=19.51，P=0.001 0），与空载体组相对表达量（0.60±0.08）相比有明显上升（P=0.003 4），模型组与注射空载体组相比无显著变化；Ephrin-B3 过表达组的PSD95 mRNA相对表达量（0.90±0.13）比模型组（0.60±0.05）表达增多，差异有统计学意义（F=14.80，P=0.020 3），与空载体组相对表达量（0.57±0.06）相比表达增多（P=0.016 0），模型组与空载体组表达水平无明显变化，结果显示Ephrin-B3过表达会引起突触相关蛋白mRNA 的表达水平升高，见图2、图3。

图3 各组NR2B、PSD95的mRNA相对表达水平Figure 3 Relative mRNA expression levels of NR2B and PSD95 in each group

2.5 Western blotting检测突触相关受体蛋白表达水平免疫印迹结果显示，转染组Ephrin-B3蛋白表达相对表达量（0.87±0.03）较模型组（0.34±0.14）显著升高（F=17.72，P=0.003 2），较空载体组相对表达水平（0.32±0.19）显著升高（P=0.003 4）。与对照组相比，致痫模型组突触后致密区蛋白PSD95 及突触后离子型谷氨酸受体NR2B在SE 24 h后表达明显下降；Ephrin-B3过表达转染组NR2B 的相对表达量（1.02±0.31）与癫痫模型组（0.50±0.20）相比显著增多（F=9.755，P=0.019 9），慢病毒转染组与空载体组相对表达量（0.48±0.23）比较NR2B的蛋白表达量明显增加，差异有统计学意义（P=0.014 4），致痫模型组与空载体组比较差异无统计学意义；转染慢病毒组PSD95蛋白相对表达量（0.93±0.10）相较于癫痫模型组（0.69±0.06）显著增加（F=7.889，P=0.014 5），较空载体组（0.71±0.04）均明显增加，差异有统计学意义（P=0.025 3），模型组与空载体组PSD95蛋白表达量比较差异无统计学意义（P=0.99）。WB 统计结果显示Ephrin-B3基因过表达会引起突触相关蛋白PSD95、NR2B表达量增多。见图4。

图4 各组Ephrin-B3、NR2B、PSD95蛋白的表达Figure 4 Expressions of Ephrin-B3, NR2B and PSD95 in each group

3 讨论

癫痫是神经系统疾病中的一种慢性常见病，以反复发作为特点［17］，病死率是一般人群的3 倍，其反复的痫性发作会给患者造成极大的心理负担。焦虑、抑郁、偏头痛等常成为癫痫患者的共患病，进一步造成患者病情恶化，因此，癫痫的有效治疗成为全球亟待解决的问题，而TLE 不仅是常见的局灶性癫痫［18-20］，也是最常见的难治性癫痫［21-23］，且具有反复发作性、短暂性、难治性的特征，其发病率也在逐年增长［24］，成为近年来研究的热点对象。Eph/Ephrin 双向信号分子可以发挥多种生理功能［25-26］，既往研究发现，Ephrinb参与到脊髓损伤、外伤性脑损伤、胶质母细胞瘤、脑血管病等的发生与发展［27］，在神经系统中也可以引导树突和轴突的生长，介导神经发生［28-29］。近年来，Ephrin-B3 在神经系统中的研究逐渐深入［8-13］，Ephrin-B3 作为Ephrinbs 家族蛋白成员之一，可广泛参与到生物的各项生长发育中，包括细胞迁移、组织发育和突触可塑性等。研究表明，在匹罗卡品致痫大鼠中增加Ephrin-B3 的刺激物或外源性Ephrin-B3 会抑制癫痫大鼠海马的神经再生，参与到癫痫的发生发展过程中［30］。但目前关于Ephrin-B3在颞叶癫痫突触重塑的具体机制并不清楚。

研究发现致痫后急性期、静止期、慢性期的Ephrin-B3蛋白表达均下调，说明Ephrin-B3在海马组织的动态变化可能与痫性发作密切相关。此外，海马PSD-95 位于突触后膜具有信息整合功能，可以调节谷氨酸受体NMDA在突触后膜的定位和转运来控制突触的可塑性［31］，在敲除PSD95的小鼠中，AMPA/NMDA 的比例降低，突触兴奋性降低［32］。Ephrin-B3具有招募和定位PSD95 的功能，可作为PSD95 的上游信号直接相互结合以控制PSD95在突触后的定位与表达，进而调控突触的可塑性［32］。N-甲基-D-天门冬氨酸受体分布于突触后致密区，受电压和配体的双重支配。NR2B是NMDA的受体亚基之一，能明确具体亚基作用，针对具体靶点进行治疗，可减轻目前药物出现的因针对整个谷氨酸受体产生的神经抑制现象［33］。在Ephrin-B3 激活Ephb2 后，Ephb2 可直接与NMDA 相互作用促使其在突触表面滞留［34］，使突触后NMDA的亚单位NR2B磷酸化水平增加，从而抑制AMPA受体在突触后膜的瞄定，突触后电位减少，导致突触兴奋性降低，诱导LTD 的形成［35］。以上结论均提示Ephrin-B3 可通过在海马调控突触后受体NMDA 的NR2B 亚基以及PSD95 诱导突触LTP 或LTD发生，从而调控突触可塑性控制癫痫发作。

本研究采用氯化锂-匹罗卡品点燃的颞叶癫痫大鼠进行脑部海马区慢病毒Ephrin-B3 注射，应用Western blot和荧光定量PCR技术检测海马区转染病毒后突触相关受体PSD95、NR2B 的mRNA 及蛋白表达水平的改变，从而检测酪氨酸蛋白激酶配体Ephrin-B3对突触可塑性的调节作用，结果发现，慢病毒转染海马组织后，组织内Ephrin-B3及突触相关受体PSD95、NR2B无论核酸水平还是蛋白水平的相对表达量均显著上调，此外，观察大鼠的癫痫发作潜伏期亦有明显上调。本研究中模型组及空载体组相较于未做任何处理的空白对照组，结果显示PSD95 及NR2B的表达水平均显著下调，提示PSD95、NR2B与TLE的发病有关，与既往研究［14，36］结果一致。上述结果可证明，大鼠海马过表达Ephrin-B3可通过在癫痫中上调突触后蛋白PSD95、NMDA的NR2B受体亚基调节癫痫发作时的放电阈值，从而调节突触的长时程抑制和长时程增强，其原因可能与Ephrin-B3抑制NR2B 在癫痫发作时向磷酸化转换有关，导致NR2B在细胞膜表达增加，而PSD95 表达增加与Ephrin-B3对其在突触后的招募有关，PSD95 可促进树棘突的成熟，与癫痫发作急性期认知功能的恢复有关［37-39］。因此，Ephrin-B3 在TLE 的发作中作为抑制因子发挥保护作用。

过表达Ephrin-B3 基因可以在动物模型中减轻大鼠的癫痫发作，其作用机制可能与控制突触后蛋白表达有关。因此，Ephrin-B3 有望成为颞叶癫痫新的治疗靶点，同时为轴突导向蛋白Ephrin-B3与突触相关蛋白PSD95和NMDA之间的功能关系提供新的见解。