高通量测序联合动物实验探索复方泽漆颗粒治疗银屑病的作用机制*

董同同,王久香,吴敏,刘涛峰

1.安徽中医药大学,安徽 合肥 230031; 2.安徽中医药大学第一附属医院,安徽 合肥 230031

银屑病(psoriasis,Ps)是一种易复发的皮肤病,又称“牛皮癣”,以红斑鳞屑为临床特征,其发病机制与环境、遗传及免疫细胞等多种因素相关[1]。此外,精神刺激、气候变化、吸烟饮酒、不良饮食习惯等也是本病的诱发或加重因素[2]。Ps的全球发病率约为0.09%～5.10%[3],中国发病率约为0.47%[4]。西医治疗Ps主要采用甲氨蝶呤、环孢素、激素类药物、生物制剂等,这些疗法均具有一定疗效,但不能根治Ps。相比之下,中药复方可以整体调节,针对多个生物过程或靶点发挥作用,逐渐成为临床治疗Ps的关注点。

复方泽漆颗粒(皖药制字BZ20080004号)在临床上应用多年,疗效显著,且无明显副作用。前期研究发现,复方泽漆颗粒能够改善Ps患者临床症状、降低银屑病皮损面积和严重程度指数(psoriasis area and severity index,PASI)评分、降低血清白细胞介素-17(interleukin-17,IL-17)水平[5-8],但其具体作用机制尚不清楚。因此,本研究基于人体皮肤组织高通量测序结果,采用复方泽漆颗粒对咪喹莫特诱导的Ps小鼠模型进行干预,观察小鼠皮损组织c-Fos、c-Jun表达情况和表皮层病理学变化,探索复方泽漆颗粒抗Ps的潜在分子机制。

1 材料

1.1 临床资料健康组:安徽中医药大学第一附属医院皮肤科就诊的非Ps患者;Ps组:2020年2月至2021年12月在安徽省中医院皮肤科就诊的Ps患者(n=10)。临床试验获安徽中医药大学医学伦理委员会审核批准,伦理审批号:2021AH-50。

1.2 实验动物BALB/c小鼠60只,体质量18～22 g,由杭州子源实验动物科技有限公司提供,许可证号:SCXK(浙)2019-0004。动物饲养于安徽中医药大学实验动物中心SPF级动物房,温度20～26 ℃,相对湿度30%～50%,通风良好。动物实验经安徽中医药大学实验动物伦理委员会批准,伦理审批号:2023023。

1.3 药物与试剂复方泽漆颗粒[6](由泽漆、白花蛇舌草、大青叶、板蓝根、鸡血藤、土茯苓、半枝莲、贯众、龙胆草、黄芩、莪术、五味子组成,安徽中医药大学第一附属医院药剂部提供,批号:20220305);GAPDH抗体、山羊抗兔IgG HRP、山羊抗小鼠IgG HRP(Proteintech公司,货号:60004-1-1、SA00001-1、SA00001-2);c-Fos抗体、c-Jun抗体(成都正能生物,货号:340249、R23335);反转录试剂盒(上海新贝生物,货号:R202-02);RNA提取试剂盒(上海奕杉生物,货号:RN001);浓缩型正常山羊血清、荧光标记山羊抗兔IgG(武汉博士德生物工程有限公司,货号:AR1009、BA1032);DAPI(碧云天,货号:C1002)。

1.4 仪器二维电泳系统(天能公司,型号:VE-180);化学发光凝胶成像系统(耶拿公司,型号:CheStudio515);全光谱波段酶标仪(上海赛默飞公司,型号:SkyHigh);荧光定量PCR仪(美国罗氏公司,型号:LightCycler 480Ⅱ);倒置荧光显微镜(Olympus 公司,型号:CK40-F200);低速离心机(可成公司,型号:L4-5K);高速冷冻离心机(Kendro公司,型号:D3752)。

2 方法

2.1 临床皮肤组织制备健康组:取患者的正常皮肤组织;Ps组:治疗前,切取患者的皮损组织。采用复方泽漆颗粒治疗,温开水冲服,饭后30 min服用,每次1袋(10 g),每日3次。经临床评估皮损症状好转后,留取患者的皮肤组织。

2.2 Ps小鼠模型制备实验前一天刮掉小鼠背部毛发,面积约2 cm×3 cm。在小鼠剃毛部位涂抹5%咪喹莫特乳膏62.5 mg,连续7 d,每天1次。造模第7天,小鼠背部出现红斑、鳞屑,提示Ps模型建立成功。

2.3 小鼠分组与给药将小鼠按随机数字表法分为空白组、模型组、复方泽漆颗粒组、甲氨蝶呤组,每组15只。除空白组外,其余各组采用“2.2”项方法进行造模。造模首日开始灌胃,剂量按人与小鼠体表面积换算,复方泽漆颗粒、甲氨蝶呤的灌胃剂量为 1 mg·kg-1,空白组与模型组给予等剂量生理盐水,早晚各1次。

2.4 小鼠皮肤组织制备末次给药后,1%戊巴比妥钠溶液麻醉小鼠(60 mg·kg-1),切取小鼠背部皮肤组织进行后续实验。

2.5 高通量测序技术检测Ps患者皮肤组织差异表达mRNA健康组和Ps患者治疗前后的皮肤组织经Trizol裂解后提取总RNA,使用微量分光光度计测定RNA纯度。检测合格的RNA样品经过DNase I消化,使用带有Oligo(dT)的磁珠富集mRNA,打断成为短片段,加入随机引物合成cDNA一链、二链,连接产物进行PCR反应,进而构建RNAseq文库,并使用Illumina二代测序技术上机检测。采用DESeq2软件对有生物学重复的样本进行分析,使用R软件中的phyper函数进行统计检验,以|log2FC|≥1、P<0.05筛选差异表达mRNA。通过美国国家生物技术信息中心(National Center for Biotechnology Information,NCBI)数据库预测差异表达mRNA的靶基因,物种设置为Homo sapiens,参考基因组版本为GCF_000001405.39_GRCh38.p13。借助R软件中的phyper函数对靶基因进行京都基因与基因组百科全书(Kyoto Encyclopedia of Genes and Genomes,KEGG)通路富集分析,以FDR≤0.05筛选KEGG通路。

2.6 Western blot检测小鼠皮肤组织c-Fos、c-Jun蛋白表达水平使用RIPA裂解缓冲液(PIPAPMSF=1001)提取小鼠皮肤组织总蛋白,配制12%分离胶,行凝胶电泳,转移蛋白至0.22 μm PVDF膜(低温,220 mA,1.5 h),使用5%脱脂牛奶封闭2 h。加入c-Fos抗体(1800)、c-Jun抗体(1800),4 ℃孵育过夜。使用磷酸盐缓冲液(PBST)洗膜3次,每次10 min。二抗(15 000)室温孵育2 h,PBST洗膜3次,每次10 min。ECL化学发光液显影,曝光和拍照。运用Image J软件分析蛋白条带灰度值,计算目的蛋白的相对表达量。

2.7 qPCR检测小鼠皮肤组织c-FosmRNA、c-JunmRNA表达水平从小鼠皮肤组织提取总RNA,将mRNA逆转录为cDNA。取5 μL cDNA作为模板,进行PCR反应,15 μL扩增体系1 μL模板cDNA、上下游引物各0.25 μL、7.5 μL SYBR Green混合液、6 μL水;扩增条件:95 ℃ 2 min预变性,95 ℃变性10 s,60 ℃退火30 s,45个循环。以Tubulin作为内参基因,以2-ΔΔCt法计算目的基因的相对表达量。通过Primer 6.0软件设计引物,由上海新贝生物科技有限公司合成引物,引物序列见表1。

表1 引物序列

2.8 HE染色观察小鼠皮肤表皮层病理学变化切取各组小鼠背部皮损区域皮肤组织或正常皮肤组织,用4%多聚甲醛溶液固定过夜;组织样本使用酒精梯度脱水、浸蜡包埋,行组织切片(厚度5 μm);石蜡切片经二甲苯脱蜡,苏木精、伊红染色,光学显微镜下观察皮肤组织表皮层病理学改变。

3 结果

3.1 Ps患者治疗前后皮肤组织高通量测序结果与治疗前比较,Ps患者治疗后的皮肤组织中mRNA下调9 670个,mRNA上调8 570个,见图1A。KEGG结果表明,IL-17信号通路可能是复方泽漆颗粒治疗银屑病的关键通路,见图1B。

注:A:差异表达mRNA火山图;B:KEGG通路富集气泡图。

3.2 Ps患者治疗前后皮肤组织c-FosmRNA、c-JunmRNA水平比较激活蛋白-1(activator protein-1,AP-1)是IL-17的下游基因,其家族蛋白(c-Fos、c-Jun)水平降低可导致Ps的发生。高通量测序结果显示,与健康组比较,Ps患者皮肤组织c-FosmRNA、c-JunmRNA水平降低(P<0.001);与治疗前比较,Ps患者治疗后c-FosmRNA、c-JunmRNA水平升高(P<0.05),见图2。

注:与健康组比较,**P<0.001;与Ps患者治疗前比较,# P<0.05。

3.3 各组小鼠皮肤组织c-Fos、c-Jun蛋白表达水平比较与空白组比较,模型组小鼠皮肤组织 c-Fos、c-Jun表达水平降低(P<0.001);与模型组比较,复方泽漆颗粒组、甲氨蝶呤组小鼠皮肤组织c-Fos、c-Jun表达水平升高(P<0.05),见图3。

注:与空白组比较,**P<0.001;与模型组比较,# P<0.05。

3.4 各组小鼠皮肤组织c-FosmRNA、c-JunmRNA水平比较与空白组比较,模型组小鼠皮肤组织c-FosmRNA、c-JunmRNA表达水平下调(P<0.001);与模型组比较,复方泽漆颗粒组、甲氨蝶呤组小鼠皮肤组织c-FosmRNA、c-JunmRNA表达水平上调(P<0.05),见图4。

注:与空白组比较,** P<0.001;与模型组比较,#P<0.05。

3.5 各组小鼠皮肤表皮层病理学变化比较HE染色结果显示,与空白组比较,模型组小鼠表皮层明显增厚,伴有表皮角化过度、表皮突规则向下延伸、棘层增厚;与模型组比较,复方泽漆颗粒组、甲氨蝶呤组小鼠表皮层和棘层变薄,表皮角化程度减轻,见图5。

图5 各组小鼠皮肤组织HE染色图片(×400)

4 讨论

中医学尚无Ps病名,依据其临床症状,将其归属于“白疕”范畴。近代皮肤外科专家赵炳南认为本病多因素体血热或郁久化热,生风化燥,日久热结血瘀,客于肌肤,因此提出“从血论治”[9]。复方泽漆颗粒以泽漆、白花蛇舌草、大青叶为君药,板蓝根凉血清热,鸡血藤养血活血,土茯苓清热利湿,半枝莲清热解毒,黄芩、龙胆草清热燥湿,贯众清气分血,莪术破血行气、消血瘀,诸药合用可有效清除体内热毒,达到清热凉血、解毒散瘀的目的[6]。

研究表明,IL-17与角质形成细胞相互作用介导炎症反应,从而参与Ps的病理改变。IL-17与IL-17受体或特定的膜结合蛋白相互作用,诱导下游形成核因子κB激活剂1(nuclear factor kappa B activator 1,ACT1)-肿瘤坏死因子受体相关因子6(tumor necrosis factor receptor associated factor 6,TRAF6)复合物,导致AP-1家族蛋白水平降低,从而促使Ps发生[10-11]。AP-1家族是一个复杂的转录因子家族,由c-Jun、Jun B、Jun D、c-Fos、FosB、Fra-1、Fra-2等构成[12],其中c-Fos和c-Jun是主要成员,他们在哺乳动物中形成异源二聚体。研究表明,银屑病进行期皮损组织中c-Fos和c-Jun表达明显下降,导致角质形成细胞增殖、分化不全及表型异常;在恢复期c-Fos和c-Jun蛋白表达升高[13-14]。另外,c-Jun升高可抑制角质形成细胞增殖[15],c-Fos降低可影响真皮间充质干细胞的增殖能力[16]。c-Fos、c-Jun降低在IL-17通路介导的Ps病理过程中发挥重要作用。

综上所述,本研究采用高通量测序技术发现 IL-17 信号通路可能是复方泽漆颗粒治疗Ps的关键通路,c-Fos和c-Jun可能是复方泽漆颗粒治疗Ps的关键靶点。通过动物实验初步验证复方泽漆颗粒可能通过上调皮肤组织c-Fos、c-Jun表达水平从而治疗Ps。