欧洲型猪繁殖与呼吸综合征病毒GD2022株的分离鉴定及遗传进化分析

邓可辉,王修武,郭智轩,韩淑杰,孙守湖,贺东生*

(1.岭南现代农业科学与技术广东省实验室肇庆分中心,广东肇庆 526238;2.华南农业大学兽医学院/广东省动物源性人兽共患病预防与控制重点实验室,广东广州 510640)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)可引起猪高病死率,为烈性接触性传染病,其病原为猪繁殖与呼吸综合征病毒(Porcine reproductive and respiratory syndrome virus,PRRSV),也称为猪蓝耳病病毒。PRRSV为单股正链RNA病毒,自2018年归属于动脉炎病毒科(Arteriviridae)、β-动脉炎病毒属(Betaarterivirus)[1]。PRRSV基因组全长约15000 nt,包含10个开放阅读框(open reading frames,ORFs),分别为ORF1a、ORF1b、ORF2a、ORF2b,ORF3～ORF7及ORF5a。PRRSV全基因组编码11种非结构蛋白、6种结构蛋白[2],其中GP5蛋白具有很高变异性,同时GP3和GP4重叠区域缺失在PRRSV-1中较为常见。

根据国际病毒分类委员会(International committee on taxonomy of viruses,ICTV)对动脉炎病毒科最新的归纳总结,显示PRRSV已经被定义为两种不同的病原,分别以Lelystad virus(LV)为代表的PRRSV-1(Betaarterivirussuid1)和以VR-2332为代表的PRRSV-2(Betaarterivirussuid2)[3],这两种病原引起的疾病症状相似,但抗原性差异较大,全基因组核苷酸同源性约60%,且致病性差异较大。国内首株PRRSV-1在2006年分离,随后相继分离出多株PRRSV-1毒株[4],目前在我国流行的大多为PRRSV-2,对PRRSV-1的深入研究较少。

本研究从2022年广东省某规模化猪场流产母猪病料中检测到PRRSV-1,并分离1株PRRSV-1毒株,命名为GD2022株,对其全基因组测序、遗传进化及重组分析,进一步了解PRRSV-1毒株在我国的流行和变异情况,丰富了我国PRRSV-1的研究资料,为PRRSV-1的深入研究及防控提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病料和病毒 2022年12月,华南地区某2 000头母猪场疑似PRRSV感染,母猪出现繁殖障碍问题持续4个月,发病猪场曾接种过PRRSV-2灭活苗,但无PRRSV-2弱毒苗的接种史,母猪出现流产、死胎、木乃伊胎等繁殖障碍症状,发病率约40%,保育猪出现被毛粗乱和呼吸道症状,整体病死和淘汰约50%。无菌采集发病猪肺脏、淋巴结、血清进行疫病检测,置-80℃冰箱备用。PRRSV-1毒株GDEU2018由华南农业大学兽医传染病室保存。

1.1.2 细胞和主要试剂 猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAMs)和Marc-145细胞由华南农业大学传染病教研室保存;HiScript Ⅱ One Step RT-PCR Kit (Dye Plus)酶、高保真酶、5 min TA/Blunt-Zero Cloning Kit、HiScript Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis Kit (+gDNA wiper)、DH5α感受态、DNA纯化试剂盒,南京诺唯赞生物科技股份有限公司产品;质粒小量提取试剂盒,广州飞扬生物工程有限公司产品;RNAfast200总RNA极速抽提试剂盒,上海飞捷生物技术有限公司产品;PRRSV N蛋白单抗,千寻生物技术有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 高速冷冻离心机,Eppendorf公司产品;倒置显微镜,奥林巴斯(中国)有限公司产品;倒置荧光显微镜、二氧化碳恒温培养箱,Thermo Fisher Scientific公司产品;凝胶成像系统,上海天能科技有限公司产品;PCR仪,Bio-Rad公司产品;透射电子显微镜,HITACHI公司产品。

1.2 方法

1.2.1 病料处理 收集的病料(肺脏或血清)加入无菌PBS缓冲液稀释,低温充分研磨,在-80℃反复冻融3次,4℃、14 000 r/min离心10 min,取上清液用0.22 μm针头过滤器滤菌,置-80℃冰箱保存备用。

1.2.2 引物的设计与合成 参考GenBank所收录的PRRSV-1和PRRSV-2代表毒株基因序列(参考毒株:VR2332,GenBank登录号:U87392;LV,GenBank登录号:M96262)设计2对检测引物。根据GenBank中收录的国内PRRSV-1全基因序列,比对后选择相对保守区域进行全基因片段扩增引物设计,共设计10对扩增PRRSV全基因引物(参考毒株:GZ11-G1,GenBank登录号:KF001144.1),引物序列均由北京擎科生物科技有限公司广州分公司合成(纯化方式:OPC)(表1),表1中1～10为全基因引物,11为PRRSV-1鉴定引物,12为PRRSV-2鉴定引物。

表1 引物序列信息

1.2.3 病料检测 参照商品化核酸提取试剂盒说明书对处理好的样品进行病毒核酸提取,用表1鉴定引物进行RT-PCR,所得产物通过1%琼脂糖核酸电泳进行鉴定。检测阳性的核酸,用HiScript Ⅲ cDNA合成试剂盒反转录为cDNA,置于-20℃低温冰箱保存备用。

1.2.4 病原分离 取阳性样品按照病料与培养基1∶10分别接种于PAMs和Marc-145细胞,同时设2组阴性对照组,在体积分数为5% CO2、37℃温箱中孵育2 h。弃上清更换维持液,体积分数为5% CO2、37℃温箱中培养5～7 d后收毒,反复冻融3次,盲传3～5代,期间若有典型细胞病变(cytopathic effect,CPE)出现,拍照记录结果,并进行RT-PCR检测。

1.2.5 分离株间接免疫荧光鉴定 将第10代含病毒的细胞培养液上清接种PAMs,同时设置正常对照,当CPE达到80%以上时用4%多聚甲醛室温固定15 min,然后加入0.3%曲拉通室温作用30 min,再用50 mL/L BSA室温封闭1 h,与稀释1 000倍的PRRSV N蛋白单克隆抗体4℃作用10 h,用稀释1 000倍的山羊抗鼠IgG在37℃避光作用1 h,最后加入DAPI遮光作用5 min,用倒置荧光显微镜观察结果。

1.2.6 分离株病毒滴度测定 用铺满单层PAMs的96孔细胞培养板进行病毒滴度测定。将在PAMs上传代的第10代病毒,用含5% FBS的RPMI1640培养基10倍倍比稀释,取10-1～10-10病毒液分别接种96孔细胞培养板。每个稀释度接种8孔,每孔100 μL。同时设8孔阴性对照,每孔再补加100 μL维持培养基。置于体积分数5% CO2细胞培养箱中37℃培养,每日观察细胞病变(CPE),连续观察4～5 d,记录每个稀释度出现CPE的孔数。采用Reed-Muench法计算TCID50。

1.2.7 病毒形态结构观察 将接毒后的PAMs培养72 h后,反复冻融3次,4℃条件下14 000 r/min离心10 min,去掉细胞碎片。取病毒悬液,滴在碳膜铜网放置5 min,用滤纸吸去多余液体,将2%磷钨酸滴在碳支持膜铜网放置2 min,用滤纸吸去多余液体,室温干燥。透射电子显微镜下观察,采集图像分析。

1.2.8 全基因组扩增及测序 取阳性病料cDNA,根据表1的引物,用高保真酶进行PCR扩增以获得病毒的基因组各片段,PCR反应程序为:95℃ 3 min;95℃ 15 s,60℃ 15 s,72℃延伸2 min 10 s,共35个循环;最后72℃延伸5 min。所得PCR产物通过1%琼脂糖核酸电泳进行鉴定。参照诺唯赞胶回收试剂盒回收PCR产物,将PCR产物连接pCE2 TA/Blunt-Zero载体,并把连接产物转化至DH5α感受态细胞,挑取单个菌落置于1 mL含氨苄抗性的LB液体培养基中过夜培养,菌液PCR鉴定阳性的阳性菌送至北京擎科生物科技有限公司广州分公司进行序列测定。

1.2.9 分离株的全基因组序列分析 用生物学软件对分段克隆的10条相互重叠的基因片段进行全基因序列拼接,得到分离株的全基因序列。用DNAstar软件中的MegAlign7.1(Clustal W)对PRRSV分离株的全基因组序列和国内外58株参考毒株全基因组序列进行核苷酸序列和编码氨基酸序列的同源性比对分析。用MEGA7.0软件(Clustal W Method分析,Neighbor-Joining Method,Bootstrap method值为1000)进行全基因组以及ORF5基因遗传进化分析并绘制系统遗传进化树。用RDP4.0软件对分离株GD2022株和58株参考株进行全基因组序列重组分析。

2 结果

2.1 病原的分离结果

第5代病毒接种PAMs,48 h后开始出现CPE,上清液RT-PCR检测为PRRSV1阳性;第8代病毒接种PAMs,48 h内可见细胞皱缩,细胞破碎等典型CPE(图1A);正常PAMs状态良好(图1B);接种Marc-145组无CPE现象,且RT-PCR检测为阴性。疑似从PRRSV阳性样品中成功分离1株病毒,命名为GD2022株。

A.接毒后的PAMs; B.正常的PAMs

2.2 分离毒株的RT-PCR鉴定结果

对第10代病毒分别用猪细小病毒、猪日本脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、2型猪繁殖与呼吸综合征病毒、1型猪繁殖与呼吸综合征病毒的引物进行RT-PCR鉴定。结果显示检测的第10代病毒中只有1型猪繁殖与呼吸综合征病毒为阳性,其目的条带大小与预期条带大小一致,而猪细小病毒、猪日本脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、2型猪繁殖与呼吸综合征病毒5种常见会引起繁殖障碍的病毒均为阴性(图2)。该结果初步表明,分离的病毒为PRRSV-1。

M.DNA标准DL 1 000; 1.阳性对照; 2.GD2022第10代病毒; 3.PRRSV-2; 4.CSFV; 5.PRV; 6.JEV; 7.PPV; 8.阴性对照

2.3 分离株间接免疫荧光鉴定

将第10代病毒样品接种PAMs,36 h后可见明显CPE,IFA试验结果显示,接毒组可检测到针对PRRSV N蛋白的特异性荧光(图3A),而对照组则无特异性荧光(图3C),表明所分离病毒为PRRSV。

A～B.PRRSV-1毒株接种PAMs;C～D.阴性对照

2.4 分离株病毒滴度测定

经TCID50测定,GD2022株在PAMs上第10代的病毒含量为106.75TCID50/mL。

2.5 病毒形态学结构观察

病毒样品经负染在透射电子显微镜下可见圆形或椭圆型的病毒粒子,直径约40～80 nm(图4)。

图4 病毒粒子透射电镜观察

2.6 全基因序列扩增结果

以阳性病料的cDNA为模板,用表1的特异性引物扩增病毒基因组的重叠片段,并连接pCE2 TA/Blunt-Zero载体,结果分段扩增该毒株的基因组片段成功构建重组质粒,各片段重组质粒通过通用引物验证,各片段大小与预期相符(图5)。

M.DNA标准DL 5 000; 1～10.片段1～10

2.7 全基因组测序结果

各片段测序结果通过生物学软件拼接校正后,得到GD2022株基因组全长为15058个核苷酸(不含polyA尾)5′UTR长222 nt,3′UTR长114 nt,与公布的PRRSV-1序列长度相似,全基因序列已上传GenBank,登录号为OQ606399。

2.8 全基因组同源性分析

用MegAlign7.1和MEGA7.0软件对GD2022和58株国内外PRRSV参考毒株进行核苷酸序列同源性分析,结果分离株GD2022与PRRSV-1毒株同源性为77.4%～87.0%,与PRRSV-1代表毒株(LV株)同源性最高为87.0%,与PRRSV-2代表毒株(VR2332株)同源性仅为59.7%。

2.9 全基因组遗传进化分析

GD2022株全基因序列与国内外55株PRRSV参考毒株全基因组进行遗传进化分析。PRRSV被定义为两种不同的病原,LV为代表的PRRSV-1(欧洲型)和以VR-2332为代表的PRRSV-2(美洲型),PRRSV-2单独成一分支。遗传进化树结果显示,GD2022株处于PRRSV-1大分支中的一小分支,且与PRRSV-1疫苗毒遗传关系较远(图6)。图6中“●”为GD2022株,“▲”为PRRSV-1疫苗毒株。基于ORF5基因进行的遗传进化分析,结果显示分离株与报道的PRRSV-1毒株均属1亚型,但在遗传进化树中单独成一分支(图7),图7中“●”为GD2022株。

图6 PRRSV全长基因组序列的遗传进化分析

图7 基于ORF5基因的遗传进化分析

2.10 编码蛋白的缺失与突变结果分析

将GD2022毒株GP3、GP4和GP5编码蛋白的氨基酸序列与国内毒株和经典毒株(LV株)进行比较分析。GD2022毒株在ORF3和ORF4重叠区域有3个核苷酸(nt)缺失,导致GP3和GP4蛋白分别在第245和第65aa位点缺失了1个氨基酸(图8A和图8B);ORF5基因编码的GP5蛋白氨基酸序列与LV株比较,在GP5蛋白中和抗原表位有1处发生突变,即第33氨基酸位点(D→A),在高变区有2处发生突变,第56氨基酸位点(D→A)和第63氨基酸位点(G→D)(图8C)。

图8 GP3、GP4、GP5结构蛋白的氨基酸序列比对

2.11 重组分析

在默认参数下用RDP4软件7种检测方法(RDP、GENCONV、MaxChi、Chimaera、BootScan、3Seq、SiScan)进行重组分析,结果显示GD2022株无重组事件发生,推测GD2022株不存在重组现象。通过一系列验证GD2022株为1株PRRSV新毒株。

3 讨论

猪繁殖与呼吸综合征给全球养猪业带来了严重的经济损失[5]。早在20世纪80年代美国首次报道PRRSV,20世纪90年代传进我国,在我国猪群中长期流行并发生广泛变异[6-7]。随后国内多地猪群都相继感染该病毒[8]。相比PRRSV-2,我国首株PRRSV-1报道较晚,2006年首次分离鉴定,随后国内多地报道PRRSV-1毒株的出现[9],表明PRRSV-1和PRRSV-2在我国猪群中同时存在[10]。由于PRRSV免疫交叉保护弱和容易发生重组[11],我国对PRRSV-1的流行情况、遗传变异等相关研究较少,需关注和监测PRRSV-1在国内的流行情况[12]。

针对广东某规模化猪场繁殖障碍母猪进行了采样检测,对引起繁殖障碍的常见病原进行检测(包括猪细小病毒、猪日本脑炎病毒、猪伪狂犬病病毒、猪瘟病毒、2型猪繁殖与呼吸综合征病毒),结果均为阴性,综合各种临床表现,怀疑猪群感染了PRRSV-1。经过检测确诊猪群为PRRSV-1感染,并用PAMs对阳性病料进行病原的分离,最后成功分离1株PRRSV-1,命名为GD2022株。为了更好了解PRRSV-1在我国流行的动态和遗传进化信息,对GD2022株进行了全基因测序及序列分析。通过基因克隆、测序、拼接,得到GD2022毒株的全基因组序列,全长为15058个核苷酸(不含polyA尾)5′UTR长222 nt,3′UTR长114 nt,全基因序列已上传至GenBank(登录号:OQ606399),丰富了国内PRRSV-1的全基因序列的数据库。通过序列分析比较,发现该毒株GP3和GP4编码蛋白重叠区分别在第245 aa位和第65 aa位缺失了1个氨基酸,GP5蛋白高变区有两处发生了突变,为第56 aa位(D→A)和第63 aa位(G→D),这种缺失和变异的出现与国内的其他PRRSV-1参考毒株有所区别,显示了PRRSV-1的持续变异性,但所发现的位点突变对PRRSV的毒力、致病性等影响目前尚不清楚,需进一步研究。

本研究所分离毒株GD2022株基因组同源性分析结果、系统遗传进化树结果和中和抗原表位的突变等均显示其与国外疫苗毒株存在显著差异,国内尚未见商品化的PRRSV-1疫苗,即使采用国外疫苗进行免疫,根据上述变异结果推测其对猪群所提供的的保护作用可能也不够,因此,该毒株的成功分离为后期PRRSV致病机制研究、诊断制剂和新型疫苗的研发打下了基础。