表达IFN-α的重组猪繁殖与呼吸综合病毒的构建及生物学特性分析

黄 静,王玉旭,王 豪,陈 樱,2,3,4,欧阳康,2,3,4,黄伟坚,2,3,4,黄稳妃,韦祖樟,2,3,4*

(1.广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室,广西南宁 530005; 2.广西壮族自治区兽用生物制品工程研究中心,广西南宁 530005; 3.广西畜禽繁育与疾病防控重点实验室,广西南宁 530004; 4.广西高校动物疫病预防与控制重点实验室,广西南宁 530005; 5.广西农业职业技术大学动物科学技术系,广西南宁 530007)

猪繁殖与呼吸综合征(Porcine reproductive and respiratory syndrome,PRRS)是影响养猪业的重要疾病之一[1],该病还会产生免疫抑制,继发其他细菌和病毒感染[2],对养猪业造成极大的影响。猪繁殖与呼吸综合征病毒(PRRSV)颗粒呈圆球形,平均大小约为60 nm,为单股正链RNA病毒[3],全长约为15 kb,全基因组包含ORF1a、ORF1b、ORF2a及2b、ORF3、ORF4、ORF5、ORF5a、ORF6和ORF7等至少10个开放阅读框(ORF)以及5′端和3′端的非编码区[4],其中ORF1a和ORF1b编码RNA依赖性RNA聚合酶等至少14个非结构蛋白,这些蛋白具有复制酶和蛋白水解酶功能,负责病毒基因组RNA的复制和亚基因组mRNA以及拮抗干扰素(interferons,IFNs)的产生。其中由ORF2-7编码的为结构蛋白。PRRSV病毒感染猪体后可长期存在于体内,实现持续性感染,并且PRRSV感染后期会引起靶细胞凋零坏死,破坏猪肺泡巨噬细胞(porcine alveolar macrophages,PAM)。猪体感染病毒后会抑制Ⅰ型干扰素的表达[5],引起免疫抑制,猪接种PRRSV活疫苗3～4周后才能产生细胞免疫应答和中和抗体,但中和抗体滴度不高[6],这些现象为PRRSV的防控带来了巨大的挑战。

干扰素(interferon,IFN)是一类具有免疫调节功能和抗病毒作用的细胞因子[7],能与细胞表面的受体结合进而启动JAK-STAT信号通路,诱导转录大量ISGs,能够起到抗病毒作用。IFN根据细胞表面受体等差异将其分为三大类[8],其中Ⅰ型的抗病毒活性最强,而猪的Ⅰ型IFN包含了17个IFN-α亚型,除了抗病毒作用外能够调节宿主的先天性和适应性免疫反应。外源性Ⅰ型IFN可增加抗病毒活性,已成功构建在PRRSV全长cDNA感染性克隆pGXAM[9],并在ORF1b和ORF2a之间插入两个限制性酶切位点BstB Ⅰ和SbfⅠ,以及转录调控序列TRS6[10]。本研究拟通过将猪Ⅰ型干扰素IFN-α插入PRRSV基因组中,以期获得能够表达IFN-α的重组PRRSV,为进一步研发能有效刺激产生免疫应答的PRRSV疫苗提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 病毒、细胞、质粒 本研究用的PRRSV感染性克隆质粒为本实验室保存[9],Marc-145细胞、PK-15细胞和PAM细胞由广西大学动物科学技术学院动物传染病与分子免疫学实验室分离保存。

1.1.2 主要试剂 引物由北京擎科生物科技有限公司合成;prime star Max DNA polymerase、T4 DNA ligase、TaqMix、dNTP、Mixture、RNase inhibitor、M-MLV、Gel extraction kit、Cycle pure kit,美国OMEGA公司产品;Axy Prep体液病毒DNA/RNA小量制备试剂盒、细胞总RNA的提取试剂盒,爱思进生物技术(杭州)有限公司产品;内切酶BstBⅠ、SbfⅠ,纽英伦生物技术(北京)有限公司产品;Trans Script®Green one-step RT-qPCR superMix、Trans5α chemically competent cell,北京全式金生物公司产品;新生胎牛血清、DMEM、MEM,GIBCO公司产品;BSA,碧云天公司产品。

1.1.3 主要仪器设备 PCR仪、细菌恒温培养箱、细胞恒温培养箱及荧光倒置显微镜,Thermo公司产品;恒温水浴锅,邦西仪器科技有限公司产品;离心机,Eppendorf公司产品;无菌操作台,苏州安泰空气技术有限公司产品;琼脂糖凝胶电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;凝胶成像仪,Bio-Rad公司产品;倒置显微镜,Nikon公司产品;罗氏96定量PCR仪,罗氏公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 参考GenBank上发表的猪源IFN-α基因序列和本实验室pGXAM序列,用Primer premier 5.0设计特异性引物,送南宁擎科生物有限公司合成(表1),表1中下划线为限制性酶切位点。

表1 本研究使用的引物

1.2.2 目的基因扩增 抽提PK-15细胞的RNA,以该RNA为模板克隆P-IFN-α目的基因。分别设计上游引物P-IFN-α-BstB I-F和下游引物P-IFN-α-SbfI-R,用细胞总RNA的抽提盒提取PK-15细胞的RNA,并用42℃、1 h的RT反应程序对该模板进行反转录获得cDNA。用以下PCR反应程序:94℃ 3 min;98℃ 10 s,56℃ 5 s,72℃ 6 s,共计35个循环;72℃ 10 min,以获得的cDNA为模板扩增目的基因P-IFN-α,用琼脂糖凝胶电泳检验PCR产物并进行胶回收。

1.2.3 重组质粒的构建 以pGXAM为载体,在ORF1b和ORF2a之间插入目的基因P-IFN-α。pGXAM载体以及目的基因的胶回收产物用限制性内切酶BstB I和SbfI进行酶切,并对酶切产物进行回收。用T4连接酶将酶切回收后的目的基因和载体置于16℃过夜连接,反应体系为T4 DNA Ligase 1 μL,pGXAM 1 μL,P-IFN-α 7 μL。连接产物转化大肠埃希菌DH5α感受态细胞,转化产物涂布于含Amp抗性的LA平板上,37℃培养12～16 h。从平板上挑取单个菌于LB培养基中培养16 h,抽提质粒,并用BstB I和SbfI对质粒进行酶切鉴定,将鉴定正确的质粒送上海生工生物公司进行测序。

1.2.4 病毒的拯救和鉴定 将BHK-21细胞铺至6孔板中,待细胞生长至80%汇合度时将鉴定正确的质粒转染至BHK-21细胞中,加入含2%血清的DMEM培养基进行培养,细胞置体积分数为5%的CO2箱中37℃培养,48 h后将细胞上清接至铺好的Marc-145细胞的6孔板上,盲传3代后对细胞上清液用引物TF11804和PR12186对产物进行RT-PCR鉴定,PCR反应体系为:94℃ 3 min;98℃ 10 s,56℃ 5 s,72℃ 6 s,共计35个循环;72℃ 10 min。

1.2.4 重组病毒的间接免疫荧光鉴定 Marc-145细胞接种至6孔板中,细胞达到90%汇合时将P3代重组病毒rGXAM-P-IFN-α以及P3代的亲本rGXAM感染至Marc-145细胞,同时设置阴性对照组,观察细胞直至出现明显CPE后即可进行间接免疫荧光实验。按照1 mL/孔加入冰甲醇固定细胞,4℃固定30 min后弃去冰甲醇并用PBS清洗3次,每孔加入1%牛血清蛋白(BSA)置于室温封闭30 min。PBS清洗3次,稀释比例为1∶2 000的PRRSV N蛋白单克隆抗体SDOW作为一抗,37℃孵育2 h。PBS清洗5次,Alexa Fluor 568标记的山羊抗鼠IgG(H+L)作为二抗,稀释比例为1∶500,37℃避光孵育1 h。PBS清洗5次至二抗充分洗涤干净后,每孔加入500 μL DAPI染液孵育5 min,清洗2次后置于荧光倒置显微镜下观察。

1.2.5 重组病毒的生长曲线 将Marc-145细胞接种至96孔细胞板中,细胞生长至90%汇合度时,取100 μL成功拯救的P3代重组病毒rGXAM-P-IFN-α以及P3代的亲本rGXAM,用含血清2%的MEM培养基按照10倍倍比稀释至10-7,并在每孔加入100 μL的病毒稀释液,用含血清2%的MEM培养基作为阴性对照,置于37℃、体积分数为5%CO2培养箱中进行培养。连续观察细胞孔内CPE情况,直至不再出现CPE后,使用Reed-Muench法计算病毒的TCID50。Marc-145细胞铺至12孔细胞板中,细胞生长至80%时,按照每孔细胞数和病毒的TCID50计算0.01 MOI所需的病毒量,将rGXAM-P-IFN-α-P3,rGXAM-P3感染至Marc-145细胞,每个病毒重复3个细胞孔,将细胞板放至培养箱中培养,定点收取12、24、36、48、60、72、96 h的病毒液,并对不同时间点收取的病毒液进行TCID50的测定,计算病毒滴度(lg TCID50/mL),用GraphPad Prism 8.0进行生长曲线的绘制。

1.2.6 重组病毒的稳定性鉴定 将鉴定阳性的细胞培养物上清接种于Marc-145细胞,培养9代,并使用检测ORF1b与ORF2a之间的外源基因的TF11804/PR12186引物对P3、P6、P9代的细胞上清液进行RT-PCR鉴定。

1.2.7 抗病毒蛋白的测定 将PAM细胞培养于12孔板中,待细胞长至80%左右汇合度时,将rGXAM-P-IFN-α-P3和rGXAM-P3根据0.1 MOI病毒感染量感染PAM细胞,并设立阴性对照组。感染后12 h、24 h收取细胞,于-80℃保存。重复3次。病毒诱导PAM细胞表达的PKR、ISG-15、ISG-54蛋白基因由RT-qPCR检测,荧光定量PCR引物和看家基因GAPDH为引物(表2)应用Roche LightCycler 96定量PCR仪检测抗病毒蛋白相对表达量。每个样本3次重复,并用2-ΔΔCt法计算结果。

表2 本研究使用的qPCR引物

2 结果

2.1 目的基因的扩增

通过PCR扩增出PK-15细胞的IFN-α片段,扩增出570 bp的条带(图1),结果符合预期。

2.2 重组质粒的构建与鉴定

将克隆扩增出的P-IFN-α片段克隆至载体pGXAM中,获得重组质粒pGXAM-P-IFN-α。用BstB I和SbfI对重组质粒进行双酶切鉴定(图2),除载体片段外,还切出约600 bp的片段,与预期大小相符,将重组质粒送上海生工生物工程有限公司测序,结果显示插入的片段为IFN-α。

M.DNA标准DL 15 000 ; 1.重组质粒pGXAM-P-IFN-α的BstB I和Sbf I双酶切

2.3 病毒的拯救与和间接免疫荧光鉴定

将构建成功的重组质粒转染至BHK-21细胞,在Marc-145细胞上盲传3代,观察Marc-145细胞上出现的CPE,收取细胞上清进行RT-PCR鉴定,结果显示拯救成功。P3代重组病毒感染Marc-145细胞,固定细胞进行间接免疫荧光鉴定(图3),感染rGXAM-P-IFN-α和rGXAM细胞中可观察到明显的绿色荧光,而未感染病毒的细胞无荧光,表明rGXAM-P-IFN-α拯救成功。

A1～A2.rGXAM感染Marc-145细胞;B1～B2.rGXAM-P-IFN-α感染Marc-145细胞;C1～C2.Marc-145细胞

2.4 病毒的生长曲线

对重组病毒的P3代进行TCID50测定,按照Reed-Muench法计算出病毒滴度(表2)。将P3代病毒rGXAM和rGXAM-P-IFN-α根据0.01 MOI的感染量感染Marc-145细胞,收取12、24、36、48、60、72、84、96 h的病毒上清,根据各毒株各时间点的病毒滴度进行生长曲线的绘制(图4),感染36 h后,重组病毒每个时间点产生的感染性病毒低于亲本病毒,72 h时rGXAM-P-IFN-α病毒滴度最高,亲本病毒rGXAM的病毒滴度84 h最高。

图4 拯救病毒的生长曲线

2.5 重组病毒的遗传稳定性

将拯救成功的重组病毒在Marc-145细胞上进行连续传代,根据引物TF11804/PR12186对P3、P6、P9代的重组病毒针对ORF1b和ORF2a之间插入的目的基因进行RT-PCR鉴定,并以rGXAM和pGXAM-P-IFN-α为对照(图5),重组病毒无明显缺失,可稳定传至P9代,回收重组病毒克隆至pMD18-T,对阳性菌液进行测序,至P9代重组病毒均能稳定遗传。

M.DNA标准DL 2 000 ;1.rGXAM-P-IFN-α-P3;2.rGXAM-P-IFN-α-P6;3.rGXAM-P-IFN-α-P9;4.阴性对照;5.rGXAM;6.pGXAM-P-IFN-α

图6 rGXAM-P-IFN-α的氨基酸比对结果

图7 PAMs被感染12 h、24 h后PKR、ISG-15和ISG-54的转录水平

2.6 抗病毒蛋白的表达

拯救成功的重组病毒感染PAM细胞,病毒诱导PAM细胞表达PKR、ISG-15、ISG-54蛋白基因由RT-qPCR检测。PAMs分别被rGXAM-P-IFN-α或亲本株rGXAM感染,未感染的PAMs作为对照,在感染后在12 h和24 h时收取细胞总RNA。用实时RT-PCR定量检测PKR、ISG-15、ISG-54的转录水平。用2-△△Ct计算结果显示,与未感染的对照组相比,抗病毒基因mRNA水平发生了成倍的变化(*P<0.05; **P<0.01;***P<0.001;****P<0.0001)。

3 讨论

本研究成功构建了以猪繁殖与呼吸综合征病毒为载体表达猪Ⅰ型干扰素α的质粒,并成功拯救出重组病毒rGXAM-P-IFN-α,该病毒在Marc-145细胞上能稳定遗传至P9代。对重组病毒的生长特性进行分析发现,rGXAM-P-IFN-α在36 h前与亲本病毒rGXAM有着相似的生长特性,36 h后rGXAM-P-IFN-α复制缓慢,病毒滴度显著低于rGXAM,可能由于rGXAM-P-IFN-α病毒中IFN-α开始表达并刺激下游的抗病毒蛋白的产生,抑制PRRSV的复制。将rGXAM-P-IFN-α感染PAM细胞后的结果也证明了这一推测,对感染重组病毒PAM细胞中的抗病毒蛋白进行定量分析,发现重组病毒rGXAM-P-IFN-α可上调IFN-α下游的PKR、ISG-15和ISG-54的转录水平,表明外源插入的IFN-α可以调节IFN信号通路,促进PAM细胞的抗病毒状态,限制病毒的复制[11]。本研究成功构建了以PRRSV为载体表达Ⅰ型α干扰素的重组病毒,为后续研制具有免疫调节作用的新型PRRSV疫苗奠定基础。