2020-2021年我国规模化猪场猪圆环病毒2型和3型的分子流行病学调查分析

陈翔鸿,曹 琪,谌 磊,邓文芳,袁 意,孔丹妮,宋文博,2*,汤细彪*

(武汉科前生物股份有限公司,湖北武汉 430070;华中农业大学动物医学院,湖北武汉 430070)

猪圆环病毒(Porcine circovirus,PCV)为圆环病毒科圆环病毒属,PCV主要有猪圆环病毒1型(Porcine circovirus,PCV1)、猪圆环病毒2型(PCV2)、猪圆环病毒3型(PCV3)和猪圆环病毒4型(Porcine circovirus,PCV4)[1-2]。PCV1是一种细胞培养污染物,与疾病没有关联。PCV2是猪圆环病毒病(Porcine circovirus disease,PCVD)的主要病原[3]。PCV3可能与猪皮炎肾病综合征、母猪繁殖障碍 、心肌炎及多系统炎症有关[4]。PCV4在我国湖南省几头患有严重呼吸道及肠道症状的猪中发现,并命名为PCV4[2]。PCV2包含2个主要的开放阅读框ORF1和ORF2,分别编码复制酶(Rep)和衣壳(Cap)蛋白,Cap蛋白是该病毒可诱导机体产生针对PCV2的中和抗体的一种重要的免疫原性蛋白[5]。与ORF1基因相比,ORF2基因表现出更多的遗传变异,通常可作为系统发育和流行病学标记。基于PCV2的ORF2中不同核苷酸位点比例将PCV2分为8个基因型,即PCV2a、b、c、d、e、f、g、h[6]。PCV3的基因组结构与PCV1和PCV2类似,ORF2 是变异最大的区域,编码唯一的结构蛋白(Cap蛋白),与病毒的感染和免疫有较强的相关性。PCV3 Cap蛋白的氨基酸数为214个,比PCV2少19～29个,与PCV1和 PCV2的基因组核苷酸同源性仅为37%左右[7]。基于Cap蛋白氨基酸序列上第24位和第27位特异性氨基酸位点的差异,将PCV3分为PCV3a、PCV3b、PCV3c共3个基因型[8]。2012-2018年我国东南地区PCV2阳性率为41.9%(272/649),PCV2d检出率为67.6%(184/272),其次为PCV2b、PCV2a、PCV2c和PCV2e[9]。2015-2018年豫南地区PCV2阳性率为27.39%(43/157),PCV2d占76.92%(10/13)[10]。2017-2018年华中地区PCV2感染率为68.53%(1091/1592),PCV2d占86.84%(33/38)[11]。2018-2020年我国不同省份PCV2的阳性率为53%(3619/6872),PCV2d占79%(49/62个样本)[12]。巴西在1967年从病料中检出了PCV3病毒,提示 PCV3多年来一直存在于猪群中[13]。2016年对安徽、重庆、福建、河南等 11 个省市的临床样品进行 PCV3检测,结果猪场阳性率为 68.6%(24/35),个体阳性率为 34.7%(77/222)[14]。2018-2021年我国PCV3总阳性率为20.78%(2177/10478),190条PCV3全基因序列中,PCV3a占41.05%(78/190),PCV3b占20.53%(39/190),PCV3c占38.42(73/190)[15]。

PCV2可在淋巴系统内增殖引起机体免疫抑制,诱发其他病原继发感染[16]。感染PCV2的猪可能会增加PRRSV的致病性[17]。PCV2和PCV3混合感染可导致母猪持续返情、屡配不孕进而引起繁殖障碍[18]。防控PCV2和PCV3感染最经济有效的方式是免疫接种,PCV3暂时无成熟的疫苗,而近年来PCV2疫苗的免疫效果不佳,这可能与PCV2基因型间存在重组、PCV2与PCV3及其他疾病的混合感染有关。 本文评估了PCV2、PCV3在猪群中的合并感染情况,在大多数感染样本中观察到2～3种病毒病原体的混合感染。基于Cap基因分析了PCV2和PCV3的遗传变异,揭示了2020-2021年我国部分地区PCV2和PCV3的分子流行趋势及混合感染情况,为科学防控该病及疫苗研发提供依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 样品 由武汉科前生物动物疫病诊断中心实验室提供,1447个疑似猪圆环病毒感染的临床样本来自2020-2021年我国13个省(直辖市、自治区)的491个规模化猪场,包括肺脏、精液、血液及胎儿胎衣等。

1.1.2 主要试剂 病毒核酸提取试剂盒,南京中科拜尔医学技术有限公司产品;琼脂糖凝胶、DNA回收试剂盒和质粒小提试剂盒,北京天根生化科技有限公司产品;2×Phanta®Flash Master Mix(Dye Plus)、2×Animal Detection U+Probe Master Mix,南京诺维赞生物科技股份有限公司产品;DH5α、pMD19-T载体和DNA Marker DL 1 000,大连宝生物工程有限公司产品。

1.1.3 主要仪器 低温冰箱,海尔集团产品;组织研磨仪,上海净信实业发展有限公司产品;台式高速冷冻离心机和Mastercyclerep 384梯度PCR仪,Eppendorf公司产品;DYY-8C电泳仪,北京六一生物科技有限公司产品;立式高压蒸汽灭菌锅,上海博讯医疗生物仪器股份有限公司产品;生物安全柜,北京东联哈尔仪器制造有限公司产品;凝胶成像系统,美国ProteinSimple公司产品;荧光定量PCR仪器,Bio-Rad公司产品。

1.2 方法

1.2.1 引物设计 在PCV2和PCV3毒株中鉴定了病毒ORF2基因的保守区域,设计验证了一组双重荧光定量探针引物,并设计了PCV2和PCV3的ORF2基因测序引物,引物和探针由艾科瑞生物科技有限公司合成(表1)。

表1 检测引物和ORF2基因扩增引物

1.2.2 病毒DNA的提取 按照病毒核酸提取试剂盒说明书操作步骤,提取病毒DNA,置于-20℃冰箱保存备用。

1.2.3 样品的荧光定量PCR(qPCR)检测 试剂配制体系和反应条件如下:Mix 10μL、DNA模板2 μL、PCV2和PCV3上、下游引物及探针各0.5 μL,加ddH2O补齐至20 μL。反应条件为:37℃ 2 min;95℃ 30 s,95℃ 10 s,60℃退火采集荧光30 s,共45个循环。

1.2.4 ORF2基因片段的扩增、克隆与鉴定 随机选取45家和47家猪场Ct值≤30的PCV2和PCV3阳性样品,提取病毒DNA进行ORF2基因的PCR扩增,反应体系为25 μL:2×Phanta®Flash Master Mix (Dye Plus) 12.5 μL,ddH2O 6.5 μL,上、下游引物各1 μL,DNA模板4 μL。反应条件为:94 ℃ 5 min;94 ℃ 30 s,55 ℃ 40 s,72 ℃延伸30 s,共35个循环;72 ℃延伸10 min。1%琼脂糖凝胶电泳分析扩增产物,回收目的片段。将回收产物与pMD19-T载体连接后转化,选单个菌落接种于含100 mg/L Amp的LB液体培养基中,37℃、300 r/min振荡培养12～16 h,提取质粒DNA,经PCR鉴定送往北京擎科生物科技有限公司测序。

1.2.5 序列的比对与分析 根据测序结果用MegAlign软件对获得的PCV2及PCV3的ORF2基因序列(表2)和GenBank中已公布的16条国内外有代表性的PCV2及PCV3的ORF2基因序列(表3)进行核苷酸及氨基酸同源性分析,并对Cap蛋白氨基酸进行多序列比对,用MEGA6软件绘制分子遗传进化树。

表2 50株PCV2和PCV3 ORF2序列信息

表3 PCV2和PCV3参考毒株序列信息

2 结果

2.1 样品的qPCR检测结果

PCV2和PCV3在1447份样品中阳性率分别为29.16%和18.93%,在规模化猪场阳性率分别为47.05%和15.68%。用qPCR方法分别进行MhP、PRRSV、PR的病原检测,从而了解其混合感染情况(图1和表4)。在规模化猪场中,PCV2和PCV3单一感染率分别为16.88%和7.79%,而PCV2和PCV3混合感染高达23.81%,PCV2与PCV3分别与PRRSV混合感染率分别为28.13%和23.37%,PCV2和PCV3、PCV2和PRRSV以及PCV3和PRRSV的混合感染率均高于PCV2和PCV3的单一感染,且存在与PRV、Mh等病原体2～4种不同程度的混合感染情况,表明2020-2021年我国规模化猪场中PCV2和PCV3混合感染率较高,且存在PCV2和PCV3多种病原体混合感染的复杂情况。

图1 不同病原体混合感染情况

2.2 ORF2基因PCR扩增鉴定结果

用测序引物PCV2-F1/R1和PCV3-F2/R2对部分阳性样本质粒DNA进行PCR扩增鉴定,分别获得大小约为958 bp和645 bp的目的条带(图2),与预期结果相符。

2.3 ORF2基因核苷酸与氨基酸同源性比对结果

用MegAlign软件对测序获取的PCV2和PCV3的ORF2基因核苷酸序列与各自对应的16个参考毒株的ORF2核苷酸和Cap蛋白氨基酸进行同源性比对,发现50个PCV2序列与参考毒株序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为75.6%～100%和83.1%～99.1%。50个PCV3序列与参考毒株序列的核苷酸和氨基酸序列同源性分别为95.9%～100%和96.3%～100%(表5)。

表5 PCV2和PCV3测序毒株ORF2的核苷酸与氨基酸同源性

2.4 ORF2基因分子遗传进化分析结果

对测序得到的PCV2和PCV3的ORF2基因核苷酸序列进行分子遗传进化分析(图3～图4),得出PCV2d占80%(40/50),PCV2a占4%(2/50),PCV2b占16%(8/50),未检测到PCV2c和PCV2e。PCV3a、PCV3b和PCV3c分别占28%(14/50)、22%(11/50)和50%(25/50),表明2020-2021年我国部分地区PCV2的主要流行基因型是PCV2d,其次为PCV2a和PCV2b。PCV3在我国部分地区的主要流行基因型为PCV3c,而PCV3a和PCV3b流行率也依然较高。

▲、■、◆、●、◇、△、○、□标记为PCV2a～PCV2h基因型参考序列

▲ PCV3a;■ PCV3b;● PCV3c

2.5 ORF2基因表达的Cap蛋白氨基酸多序列比对分析结果

以PCV2毒株CN/BDH/2010,GenBank(no.HM038017.1)为参考序列,对部分PCV2毒株的ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸序列进行比对分析(图5),图5中方框位置为蛋白表位。I53、K59、R63、N68、L89、T90、T121、N134、R/G169、D210、I215是PCV2d的特异性突变位点,可根据基因测序结果区分PCV2d和PCV2b,能为PCV2的分子分析提供理论基础。Cap蛋白氨基酸主要变异位点为53-91、121-136、169-215氨基酸位点,此外还存在一些分散的突变位点,如R8Y、V30L、T121S,R169S/A、D210E/A等。以PCV3毒株US/MO2015,GenBank(no.KX778720.1)为参考序列,对部分PCV3毒株ORF2基因编码的Cap蛋白氨基酸序列进行变异位点比较,图6中方框位置为蛋白表位,可以看出PCV3的Cap蛋白氨基酸共有8个突变位点,其中A24V、R27K、S77T是全球范围PCV3公认的Cap蛋白氨基酸突变位点。根据Cap蛋白A24V和R2K两个突变位点,可将50个PCV3毒株划分为PCV3a(A24和R27)、PCV3b(A24和K27)和PCV3c(V24和K37),氨基酸高频突变主要位于24、27、104和150位点。

图5 PCV2 Cap蛋白氨基酸多序列比对

图6 PCV3 Cap蛋白氨基酸多序列比对

3 讨论

本研究结果显示,2020-2021年我国规模化猪场PCV2的样本阳性率29.16%,PCV3的样本阳性率为18.93%。PCV2和PCV3、PCV2和PRRSV以及PCV3和PRRSV的混合感染率均高于PCV2和PCV3的单一感染,且存在与PRV、Mh等病原体的混合感染,表明2020-2021年我国规模化猪场中PCV2和PCV3混合感染率仍然较高,且存在PCV2和PCV3与多种病原体混合感染的复杂情况。本文分别随机选取50份检测到的PCV2和PCV3阳性样品,对其ORF2基因全序列分析,发现PCV2d阳性率为80%,与前期研究中2012-2018年东南地区(67.6%)、豫南地区(76.92%)、华中地区(86.84%)和2018-2020年多省份地区(79%)接近,进一步证实了PCV2d基因型毒株已成为PCV2优势流行毒株。PCV3c阳性率为50%,占比最高,其次为PCV3a和PCV3b。PCV3a为中部地区湖北、山西、安徽等省份的主要流行基因型,与之前的研究华中地区2013-2021年PCV3c占比50%(4/8)[15]相符。而PCV3b感染的省份中也覆盖了PCV3a和PCV3c的感染分布区域,预示着PCV3的变异情况在我国规模化猪场中普遍存在,且PCV3优势基型已从PCV3a向PCV3c转变。

本研究分析的样本数量虽然相对较少,但样本来源于我国养猪规模比较集约化的13个省份,其分子病原学的检测结果仍可作为我国部分地区当前PCV2和PCV3流行的参考依据。在非洲猪瘟防控常态化的形势下,加强PCV2疫苗免疫的同时,加强对疑似PCV感染猪进行分子病原学检测及血清学监测是当下PCV防控和预警的有效手段。

对PCV2和PCV3的ORF2编码的Cap蛋白氨基酸序列进行变异位点分析,发现PCV2的Cap蛋白氨基酸序列在53-91、121-136、169-215氨基酸位点几个区域有较高的变异,同时存在一些分散的突变位点,如R8Y、V30L、T121S、R169S/A、D210E/A等,与前期研究报道吻合[19],表明Cap蛋白中的氨基酸突变可能与PCV2基因型多样性的发生有关。PCV3的Cap蛋白氨基酸序列比对分析显示多个毒株的氨基酸序列存在相似的突变现象,氨基酸高频突变位于24、27、77和150位点,与近期研究结果一致[20]。通过比较发现PCV3的Cap蛋白氨基酸突变位点突变较少,且较为集中,主要位于1-30区域,而PCV2的Cap蛋白氨基酸突变位点多而分散。根据两者的Cap蛋白氨基酸变异位点的特点,推断PCV2基因型间的重组和突变的概率可能更大而快,PCV3则较小而慢。从氨基酸同源性上比较,推断二者存在交叉免疫保护的概率较小或二者间的交叉保护力很低。不同毒株序列的氨基酸突变位点与毒力差异的相关性,PCV2与PCV3不同基因亚型之间是否存在基因重组有待进一步研究。

有研究表明,杆状病毒表达的基于PCV2d的Cap蛋白可以诱导机体产生出比传统病毒疫苗更高的体液免疫和细胞免疫水平。这种亚单位疫苗可以有效减少自然感染PCV2d的猪的病毒血症[21]。目前预防PCV2病毒感染大多用PCV2b Cap蛋白疫苗,根据以往及2020-2021年我国部分地区PCV2和PCV3的分子流行病学研究结果,开发出特异性更好的PCV2d高效亚单位疫苗迫在眉睫,而PCV2d亚单位疫苗的研究思路也可以为PCV3疫苗的研发提供启示和指导。