清肾颗粒对5/6肾切除大鼠肾组织线粒体自噬及肾小管上皮-间质细胞转化的影响*

张叶青，金华，张磊，呼琴，王亿平，代明扬

1 安徽中医药大学 安徽合肥 230038

2 安徽中医药大学第一附属医院 安徽合肥 230031

肾纤维化（renal fibrosis，RF）是各种类型慢性肾脏病（Chronic Kidney Disease，CKD）发展过程中重要的病理生理改变，以正常肾单位丢失、大量成纤维细胞及肌成纤维细胞增生、细胞外基质堆积而导致肾小球硬化、肾小管间质纤维化为特征。肾小管上皮-间质细胞转化（Epithelial-mesenchymal，EMT)已被确认为是RF的主要因素[1]。在EMT过程中，上皮细胞失去极性和上皮表面标记物如E-钙黏蛋白（Ecadherin），转而获得间充质特征如α-平滑肌肌动蛋白（α-SMA），最终转变为肌成纤维细胞，破坏肾脏结构，逐渐发展成肾纤维化[2]。线粒体自噬是一种重要线粒体质量控制机制，通过持续清理衰老和损伤的线粒体，确保线粒体能循环利用。线粒体自噬主要由PINK1/Parkin通路介导[3]。线粒体自噬与肾小管EMT之间的关系目前报道不多，通过调节线粒体自噬活性来减轻肾小管EMT进程可能成为中药抗肾纤维化的重要靶点。本研究将采用5/6肾切除大鼠建立肾脏纤维化动物模型，观察清肾颗粒对模型大鼠的肾组织线粒体自噬及肾小管EMT的影响，为其抗肾纤维化提供理论依据。

材料与方法

1 实验动物

选用SPF级雄性SD大鼠20只，2月龄，体重（200±20）g，适应性饲养1周，均购自安徽医科大学实验动物中心，许可证号：SCXK（苏）2022-0005。本研究通过安徽中医药大学伦理委员会审核（伦理批号AHUCM-rats-2022071）。

2 用药

清肾颗粒：由安徽省中医院制剂室生产，皖药制字BZ20080011，批号20210215，规格10g/袋（约含生药34g），由茵陈、丹参、生大黄、白花蛇舌草、白术、薏苡仁、泽泻、黄连、车前草组成。

3 试剂

Wes tern一抗二抗去除液（Beyotime，批号0514-18180626）；PVDF膜（Millipore，批号R7SA9081E）；ECL超敏发光试剂盒（Thermo，批号VC298015）；山羊抗小鼠IgG（Zsbio，批号140193）；山羊抗兔IgG（Zsbio，批号202700514）；GAPDH（Zsbio，批号210040421）；Pink1（Bioss）；Parkin（Santa Cruz， 批号K1120）；LC3B（CST，批号13）；α-SMA（bioss，批号AG03286338）。

4 仪器

离心机（上海和欣科教设备有限公司）；电泳仪、电泳槽、转膜仪（上海天能科技有限公司）；自动曝光仪（上海培清科技有限公司）；荧光显微镜（日本Motic BA410E）；激光共聚焦成像分析系统（美国PerkinElmer公司）；透射电子显微镜（日本电子JEM-1400 Flash）。

5 方法

5.1 大鼠模型建立及分组 SPF级雄性SD大鼠30只，2月龄，体重（200±20）g，适应性饲养1周，随机分为假手术组、模型组、清肾颗粒组，每组各10只。除假手术组外，其余20只大鼠均制作5/6肾切除模型。采用腹腔注射以2%的戊巴比妥（0.2mL/100g）对大鼠进行麻醉，俯卧位固定于手术台上，从距左脊肋骨1.5cm处斜向外方切口，暴露左肾，分离肾周围脂肪囊后，弧行切除肾上、下极各1/3，明胶海绵压迫止血1min，复位肾脏，缝合。1周后切除整个右肾。共切除5/6肾脏。假手术组只进行左右肾包膜剥离，保留肾脏及肾上腺。各组术后予青霉素预防感染。

5.2 大鼠给药方法、标本采集 各组均在造模后第1天开始灌胃，清肾颗粒组给予清肾颗粒水溶液按8.0g/kg·d灌胃，1次/d，每次3mL。假手术组、模型组大鼠用等量蒸馏水（3mL）灌胃。连续给药8周。无菌采取腹主动脉血，代谢笼留取24h尿液并记录尿量，留取左侧肾脏。将部分肾脏放入液氮罐速冻后置于-80℃冰箱中保存，用于提取蛋白；部分肾脏用生理盐水冲洗干净后置于冰上，OTC包埋后制作冰冻切片，用于免疫荧光检测；部分肾脏置于10%福尔马林液中固定，制作石蜡切片，用于光镜观察；部分肾脏制作超薄切片，用于透射电镜观察线粒体超微结构。

5.3 检测指标

5.3.1 ELISA法检测血肌酐（Serum creatinine， Scr）、尿肌酐（Urine creatinine， Ucr）浓度 按ELISA试剂盒说明书操作，并根据Scr、Ucr浓度及24h尿量计算内生肌酐清除率（endogenous creatinine clearance rate， Ccr），按体重进行校正。校正后Ccr= Ucr浓度（μmol/L）×24h尿量（mL）/（Scr浓度（μmol/L）×1440min）/体重（kg）。

5.3.2 Western blot法检测肾组织中Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表达 肾脏50mg加入1ml组织裂解液（RIPA）及蛋白酶抑制剂制备组织匀浆，提取总蛋白并测量蛋白浓度。分离总蛋白，电泳并转膜。封闭2h，TBST洗膜，加入一抗孵育，4℃过夜。第2天洗膜后，将膜与适当的二抗室温轻摇孵育1h后洗膜。使用ECL发光试剂盒来检测蛋白。使用Image J软件以目标蛋白与内参照GAPDH的灰度值比值做统计分析。

5.3.3 免疫荧光法检测肾组织中LC3-Ⅱ和线粒体膜蛋白VDAC1共定位表达 肾组织OTC包埋后制5μm冰冻切片，冰丙酮室温固定5min后，先用PBS（0.01mol/L）清洗3次（每次10min），再用正常山羊血清封闭30min（37℃），倾去勿洗；然后滴加一抗（VDAC1）孵育（4℃，过夜），次日拿出湿盒，弃一抗，PBS清洗3次（每次3min），然后滴加荧光标记的二抗，室温下孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后滴加一抗（LC3Ⅱ），37℃温箱中孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后滴二抗，室温下孵育60min；PBS清洗3次（每次3min），然后用DAPI染色大约2min，再用PBS充分淋洗1次，3min；激光共聚焦显微镜下观察、拍照。

5.3.4 HE和Masson染色光镜观察大鼠肾脏病理改变 肾脏组织标本经常规固定、包埋，制成厚度2μm的组织切片，行HE、Masson染色。

5.3.5 透射电镜观察肾小管上皮细胞中线粒体的超微结构 肾脏组织用3%戊二醛固定、PBS漂洗、1%锇酸后固定1h，再经过酒精、丙酮逐级脱水，环氧树脂618包埋，甲苯胺蓝染色后定位、切片，制成厚度约50～70nm的超薄切片，最后经醋酸铀、柠檬酸铅分别染色后，利用透射电镜下观察肾小管上皮细胞线粒体的形态及结构变化。

6 统计学方法

所有数据均采用 SPSS 26.0 软件进行统计分析。计量资料以（±s）表示。资料符合正态性且方差齐用t检验及单因素分析法分析比较；若资料不符合正态分布或方差不齐则采用非参数检验。P＜0.05认为差异有显著统计学意义，P＜0.01认为差异有非常显著意义。

结 果

1 各组大鼠Scr、Ccr比较

与假手术组比较，模型组大鼠的Scr浓度显著升高，而Ccr显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，清肾颗粒组大鼠的Scr浓度显著降低，而Ccr显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05），见表1。假手术组1033.42±5.395.36±1.54模型组7124.96±14.971.42±0.60清肾颗粒组877.90±10.692.27±0.64

表1 各组大鼠Scr、Ccr比较（±s）

表1 各组大鼠Scr、Ccr比较（±s）

分组只数Scr/μmol·L-1Ccr/ml·min-1·kg-1

2 各组大鼠肾组织中Pink1、Parkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表达比较

与假手术组比较，模型组大鼠的线粒体自噬相关蛋白Pink1、Parkin、LC3Ⅱ表达量均显著下降，肾小管EMT标志蛋白α-SMA显著升高，差异有统计学意义（P＜0.05）。与模型组比较，清肾颗粒组大鼠的Pink1、LC3Ⅱ蛋白表达量显著升高，α-SMA表达量显著降低，差异有统计学意义（P＜0.05），Parkin亦有所升高，但差异无统计学意义（P＞0.05）。见表2，图1。

图1 各组大鼠肾组织中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ、α-SMA蛋白表达比较（Western blot）

表2 各组大鼠肾组织中Pink1、Pa rkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表达比较（±s）

表2 各组大鼠肾组织中Pink1、Pa rkin、LC3-Ⅱ、α-SMA蛋白表达比较（±s）

分组例数Pink1ParkinLC3-Ⅱα-SMA假手术组101.86±0.232.18±0.132.11±0.331.39±0.40模型组71.41±0.221.66±0.371.10±0.202.47±0.24清肾颗粒组81.66±0.101.85±0.501.48±0.161.91±0.30

3 各组大鼠测肾组织中LC3-Ⅱ和线粒体膜蛋白VDAC1共定位表达情况

与假手术组比较，模型组大鼠（5/6肾切除）肾小管上皮细胞中线粒体标记物VDAC1和自噬标记物LC3-Ⅱ的共定位表达显著升高；与模型组比较，清肾颗粒组大鼠肾小管上皮细胞中VDAC1和LC3-Ⅱ共定位表达进一步显著升高。见图2。

图2 免疫荧光法检测肾小管LC3Ⅱ和VDAC1共定位表达情况（×200）

4 各组大鼠肾脏病理改变

HE和Masson染色后，光镜观察发现：假手术组大鼠的肾小球未见萎缩，肾小管管腔大而规则，呈叠瓦状分布，肾间质未见明显炎性细胞浸润。模型组大鼠可见肾间质区域大量纤维化及炎性细胞浸润，纤维化区域呈蓝染胶原纤维分布；部分肾小球硬化，肾小管管腔扩张及上皮细胞空泡变性，甚至萎缩、坏死及脱落。清肾颗粒组大鼠肾脏病理损害明显减轻，纤维化程度逐渐减轻，蓝染胶原纤维及炎性细胞浸润减少。见图3。

图3 各组大鼠肾脏组织光镜观察（HE和Masson染色）

5 各组大鼠肾小管上皮细胞中线粒体的超微结构

透射电镜观察显示：假手术组大鼠肾小管上皮细胞中的线粒体排列整齐、完整，线粒体脊清晰、连续。模型组大鼠（5/6肾切除）肾小管上皮细胞中的线粒体损伤明显，细胞核凋亡，组织坏死，大量成纤维细胞生成（红色箭头）；线粒体脊断裂、肿胀、空泡样变（红色方框内）。清肾颗粒组大鼠肾小管上皮细胞中的线粒体损伤较模型组减轻（红色方框内）；可见自噬线粒体（黄色箭头）。见图4。

图4 透射电镜检测各组大鼠肾小管上皮细胞中线粒体的超微结构

讨 论

CKD主要病理改变为肾脏纤维化，而肾小管EMT是引起肾间质纤维化（RIF）的关键事件，表现为上皮细胞获得间质细胞表型、间质细胞标志物（如α-SMA）表达增多等[4]。线粒体自噬在纤维化疾病中起关键作用，其通过减少线粒体释放活性氧、促凋亡物质，缓解炎症和氧化应激损伤，减少细胞凋亡，发挥抗纤维化的作用[5]。肾小管上皮细胞富含线粒体，对缺血缺氧十分敏感，线粒体自噬介导的线粒体质量控制对于调节肾脏中的细胞稳态是极其关键的[6]。线粒体自噬在急性肾损伤和慢性肾脏疾病的进展中起着重要作用。研究表明，通过抑制PINK1/Parkin通路负性调节线粒体自噬，能够加重肾缺血再灌注损伤[7]。通过抑制糖尿病肾病中PINK1介导的线粒体自噬，能够加重肾纤维化进程[8]。而通过介导线粒体自噬活性增强，能够抑制ROS和NLRP3炎症小体激活，进而发挥抗肾纤维化作用[9]。因此，恢复线粒体自噬平衡作为治疗肾间质纤维化的药理学靶点的可能性，为更有效地抗肾脏纤维化、延缓慢性肾脏病的进展提供新思路[10]。

PINK1/Parkin通路是介导线粒体自噬的主要信号通路，有研究发现PINK1/Parkin介导的线粒体自噬是清除受损线粒体的主要通路，上调该通路可激活线粒体自噬，对保护肾功能，对改善由缺血、缺氧引起的细胞稳态失衡有重要作用[11-12]。PINK1和Parkin位于同一条信号通路上，且PINK1是使得parkin转位至受损线粒体上募集的关键蛋白[13]。当线粒体受到破坏时，PINK1会堆积在线粒体外膜上并完成自我激活，将胞浆里的Parkin蛋白分子募集到受损伤的线粒体中，此时，PINK1和Parkin通过泛素磷酸化激活了线粒体自噬机制，随后蓄积P62蛋白，P62与LC3-Ⅱ结合并相互作用，促使线粒体自噬体的形成[14-15]。同时，在自噬起始时Beclin1通过PI3k和Atg14形成三聚体，并不断招募自噬相关蛋白介导线粒体自噬[16-17]。最后，细胞质基质型LC3（即LC3-Ⅰ）会酶解掉一小段多肽，转变为（自噬体）膜型（即LC3-Ⅱ），LC3-Ⅱ蛋白能促使线粒体自噬体与溶酶体融合，形成成熟的线粒体自噬溶酶体，启动受损线粒体的降解程序[18]。因此LC3-Ⅱ在自噬体形成中发挥至关重要的作用，可反映自噬活动，是研究自噬活动的特异性指标。5/6肾切除大鼠是经典的肾间质纤维化动物模型，本研究结果发现，5/6肾切除大鼠除表现为肾间质纤维化之外，还可见部分肾小球硬化、肾小管萎缩；模型组大鼠的Scr浓度显著升高，而Ccr显著降低，提示肾功能损害严重。研究结果还发现，在模型组大鼠肾组织中Pink1、Parkin、LC3Ⅱ表达显著降低，α-SMA表达显著升高；模型组大鼠的肾小管上皮细胞中线粒体标记物VDAC1和自噬标记物LC3-Ⅱ的共定位表达显著升高；透射电镜也显示模型组大鼠的肾小管上皮细胞中的线粒体损伤明显，细胞核凋亡，组织坏死，大量成纤维细胞生成。上述研究结果提示在肾小管转分化进程中，肾小管上皮细胞中线粒体发生损伤，Pink1/Parkin通路活性及其介导的线粒体自噬活性是下降的。

针对慢性肾脏病“湿热伤肾、湿热与瘀交结”的病机，本研究团队开发出具有清热化湿祛瘀功效的中药清肾颗粒并成功应用于临床治疗CKD，取得良好临床疗效。多中心、随机对照临床试验证实清肾颗粒能够有效改善CKD湿热证患者的临床症状、提高生活质量、延缓肾衰竭进展；有效改善肾性贫血、营养不良、钙磷代谢紊乱、胃肠功能紊乱等CKD并发症；且安全性良好[19]。前期研究也发现，清肾颗粒治疗慢性肾脏病患者和抗肾纤维化机制中具有多环节、多靶点、多途径作用特点[20-25]。本实验结果也发现，清肾颗粒能够改善5/6肾切除大鼠的Ccr，并能够增强Pink1/Parkin介导的肾小管上皮细胞中线粒体自噬活性，进而起到减轻肾小管EMT进程，发挥抗肾脏纤维化作用，这为中医药防治CKD提供新的思路和方向。