金银花绿原酸对铝致阿尔茨海默病模型小鼠相关分泌酶、脂氧素A4和生化指标的影响

农 嵩,黄佳铃,黄翠娟,唐小棉,周维铭,俸翰超,韦翠萍,黄鸥飞,张树球

(1. 右江民族医学院,广西 百色 533000;2. 广西云球生物科技有限公司研究院, 广西 百色 533000;3. 广西百色清醒科技有限公司研究中心,广西 百色 533000)

阿尔茨海默病(Alzheimer’s disease,AD)的发病机制复杂,β淀粉样蛋白(Aβ)级联学说是目前公认度最高的发病机制之一,该学说认为脑内Aβ聚集是AD患者的原发性改变,其他病理过程均由Aβ产生和清除的不平衡所致。其中β-分泌酶起到重要作用,抑制β-分泌酶可限制Aβ的产生,故寻找具有抑制β-分泌酶活性的物质对AD的防治具有重要意义[1]。铝为一种慢性神经毒物,其会大量存在于脑神经纤维缠结(NFT)并引起AD[2]。目前AD临床上尚无根治药物,中医中药在治疗AD方面由于不良反应少、成本低廉而日益受到重视。本研究采用超声辅助醇提法提取金银花中绿原酸,通过腹腔注射麦芽酚铝溶液建立铝中毒致AD小鼠模型,观察了绿原酸对染毒小鼠学习记忆力和大脑相关分泌酶、脂氧素A4(LXA4)及血液生化指标的影响,以阐明中药有效成分干预AD形成的机制,开发有效的抗AD新药。

1 实验材料与方法

1.1实验动物 SPF级小鼠70只(雌性38只,雄性32只),体重25～30 g,购自长沙市天勤生物技术有限公司,生产许可证号： SCXK(湘)2022-0011。放独立式鼠笼饲养箱(广东珠海市再鑫仪器有限公司)内饲养,每笼3～5只,编号,雌雄分开,自由饮用自来水,空气过滤净化,室温空调26 ～ 28 ℃,适应环境7 d。通过实验动物使用和伦理审查申请后进行实验。

1.2药品 将金银花干品(市售,广西百色市)在65 ℃恒温烘箱中烘至恒重,粉碎后过30～120目筛,制备成风干样品,按参考文献[3]方法提取绿原酸,测定其含量为3.6 mg/mL。绿原酸标准品(上海原叶生物科技有限公司)。

1.3主要试剂与仪器 β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、乙酰胆碱酯酶(AchE)、总胆固醇(TC)、三酰甘油(TG)、高密度脂蛋白胆固醇(HDL-C)、血糖、丙氨酸氨基转移酶(ALT)、总蛋白、尿素氮(BUN)、尿酸(UA)、肌酐(Cr)测试盒和结晶氯化铝(AlCl3·6H2O)、氯化钠、麦芽酚、无水乙醇(分析纯)、生理盐水(广西南宁市聚源仪器仪表有限责任公司),pH7.4的0.01 mol/L磷酸缓冲液(PBS); SpectraMax M5型酶标仪、Y型水迷宫刺激器、UV-5500型紫外可见分光光度计(上海元析科学仪器有限公司),FB224型电子天平(上海舜宇恒平科学仪器有限公司),FZ102型植物粉碎机(天津市泰斯特仪器有限公司),N-1100S-WD型旋转蒸发仪(日本东京理化),SM900A型超声波细胞粉碎机(南京舜玛仪器设备有限公司),DS-5510DTH型超声波清洗机(上海生析超声仪器有限公司),Master touch 602型超纯水仪(上海和泰),DGT-G135S型电热鼓风干燥箱(合肥达斯卡特生物科技有限公司),TG16-WS型高速台式离心机(湖南湘仪),HH-42型数显式电热恒温水温箱(上海跃进)。

1.4分组、造模及干预 将小鼠随机分为正常组,模型组及金银花绿原酸低、中、高剂量组,每组14只。除正常组外,其余组小鼠均给予麦芽酚铝溶液(将等体积的麦芽酚溶液和三氯化铝溶液混合,调pH至7.1～7.4,抽滤后使用)0.8 mg/(kg·d)腹腔注射染毒,每连续注射5 d间歇2 d,共染毒8周。从染毒第5周开始,金银花绿原酸低、中、高剂量组分别给予金银花绿原酸溶液40 mg/kg、80 mg/kg、160 mg/kg(按金银花提取绿原酸含量3.6 mg/mL换算给药量)灌胃,正常组和模型组灌喂等体积蒸馏水,均1次/d,直至实验结束。实验过程中,所有小鼠饲以普通饲料,自由饮水和进食,自然昼夜节律光照,笼具、饮水瓶等用具均不使用含铝制品;每天观察记录小鼠行为及粪便、脱毛、进食、消瘦、死亡等情况。

1.5检测指标及方法

1.5.1学习记忆能力 实验结束后,参照文献[4]方法,采用Y型水迷宫刺激器检测各组小鼠的学习记忆能力,记录各组小鼠达到学会标准时所需的测试次数、20次测试中的记忆错误次数和错误率。

1.5.2脑组织中相关分泌酶和LXA4含量 水迷宫实验结束后处死各组小鼠,取大脑组织,置于-20 ℃冰箱冷冻贮存待用,临用前以0.01 mol/L的PBS清洗脑组织表面血迹,滤纸吸干,称重,在冰浴下用玻璃匀浆器研磨10 min,以PBS制成10%脑匀浆,取上清贮存于-20 ℃冰箱。按照酶联免疫吸附测定试剂盒说明步骤,测定匀浆中 β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4和AchE含量。每个样品设立相应复孔,所有样品的测试结果都在标准曲线范围内。

1.5.3血清生化指标 实验结束处死前各组小鼠从眼球取血,分离血清, 按试剂盒说明书操作步骤检测血糖、TC、TG、HDL-C、总蛋白、ALT、BUN、Cr、UA水平。

2 结 果

2.1各组小鼠存活情况及状态 实验结束后,正常组13只、模型组11只、绿原酸低剂量组12只、绿原酸中剂量组11只、绿原酸高剂量组12只小鼠存活,模型组小鼠相对消瘦、行动迟缓,其余各组无异常临床表现。

2.2各组小鼠的学习和记忆情况 模型组小鼠学习测试次数、记忆错误次数和错误率均明显高于正常组(P均<0.05),金银花绿原酸各组小鼠学习测试次数、记忆错误次数和错误率均明显低于模型组(P均<0.05),绿原酸高剂量组小鼠学习测试次数、记忆错误次数均明显低于绿原酸低剂量组(P均<0.05),绿原酸各剂量组错误率比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表1。

表1 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠学习和记忆测试结果比较

2.3各组小鼠脑组织中β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、AchE含量比较 模型组和金银花绿原酸各组β-分泌酶含量均明显高于正常组(P均<0.05),金银花绿原酸各组均明显低于模型组(P均<0.05);各组α-分泌酶含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05);模型组γ-分泌酶、AchE含量均明显高于正常组(P均<0.05),金银花绿原酸各组γ-分泌酶、AchE含量均明显低于模型组(P均<0.05);模型组和金银花绿原酸低、中剂量组LXA4含量均明显低于正常组(P均<0.05),金银花绿原酸高剂量组明显高于模型组(P<0.05);金银花绿原酸各组β-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、AchE含量比较差异均无统计学意义(P均>0.05)。见表2。

表2 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠脑组织中β-分泌酶、α-分泌酶、γ-分泌酶、LXA4、AchE含量比较

2.4各组小鼠血清生化指标水平比较 模型组血糖、TC、TG、ALT、BUN、Cr、UA水平和金银花绿原酸低、中剂量组TC、TG、BUN水平均明显高于正常组(P均<0.05),模型组HDL-C水平和金银花绿原酸中、高剂量组UA水平均明显低于正常组(P均<0.05)。金银花绿原酸各组血糖、ALT、BUN、UA水平和金银花绿原酸中、高剂量组TC、Cr水平及金银花绿原酸高剂量组TG水平均明显低于模型组(P均<0.05),金银花绿原酸中、高剂量组HDL-C水平和金银花绿原酸高剂组总蛋白水平均明显高于模型组(P均<0.05)。见表3。

表3 正常组和阿尔茨海默病各组小鼠血清各生化指标水平比较

3 讨 论

生理情况下,脑内神经元胞体分泌的β淀粉样前体蛋白(APP)由α-分泌酶、β-分泌酶和γ-分泌酶对其裂解,α-分泌酶在APP的Aβ结构域内进行水解,产物为对神经元具有保护作用的sAPPα,而β-分泌酶和γ-分泌酶协同裂解则产生Aβ1-40和Aβ1-42,Aβ1-40和Aβ1-42是构成老年斑(SP)的主要成分。根据β淀粉样蛋白级联学说,Aβ的形成和转化在AD发病分子机制中处于中心位置,Aβ是各种原因诱导AD的共同通路,是AD形成和转化的关键因素[5-6]。目前抑制β-分泌酶或减少Aβ的产生是防治AD的主要研究方向。LXA4是一种内源性的抗炎分子,具有抑制AD进展的活性,并能改善AD[7-8]。脑AchE含量与脑组织损伤密切相关,其含量升高说明脑组织由于受到损伤而通过神经再生对脑组织进行损伤修复,但大量的AchE可导致行动迟缓,可能也是导致学习记忆能力发生障碍的原因之一[9]。

金银花即忍冬,课题组前期研究发现金银花可减轻AD模型小鼠脑组织病理变化[10],可通过降低Aβ1-42,避免tau蛋白过度磷酸化及总tau蛋白含量异常增加[2],具有干预铝暴露致AD的作用,且对心脏铝有一定的促排作用[11]。其具有促进重金属排泄的作用可能与中药植物中的有机酸与重金属离子络合而加速其排泄有关[12]。绿原酸是金银花主要的有效成分,是植物细胞在有氧呼吸过程中经草莽酸途径产生的一种苯丙素类物质,其含量是衡量金银花品质的重要指标。近年来绿原酸作为国际公认的植物黄金引起了广泛关注,其具有较强的生物学活性,如抗炎、抗肿瘤、抗菌、抗氧化、降血糖、拮抗铝神经毒性等[13]。金银花绿原酸是酚型抗氧化剂[14],可通过提高抗氧化能力来抑制Aβ诱导的海马神经元凋亡、线粒体损伤和细胞内质网应状态,保护神经功能[15];还可通过提高机体抗氧化能力,降低海马APP、Aβ1-42、磷酸化tau蛋白表达而改善AD小鼠的认知功能[16]。张馨予[17]研究发现,绿原酸可通过螯合和抗氧化作用减轻铝暴露诱导的细胞毒性,并可通过调节Akt/GSK-3β信号通路减少铝暴露诱导的Aβ1-42的产生从而发挥神经保护作用。

研究表明,亚慢性铝暴露可以引起小鼠大脑皮质的表达增加,可造成Aβ生成增多,或通过间接的途径对神经产生毒性,使神经元变性死亡,从而引起不可逆的学习记忆及认知功能障碍[18]。麦芽酚是铝的良好配体,与铝有高度亲和力,故本实验采用麦芽酚铝作为染毒剂建立AD动物模型,该方法建立的模型是较理想的铝中毒模型。本实验结果显示,模型组小鼠的记忆能力和脑组织中LXA4含量明显低于正常组,脑组织中β-分泌酶、γ-分泌酶、AchE含量明显高于正常组,血糖、血脂、尿酸、肝肾功能指标出现异常;与模型组比较,金银花绿原酸各组记忆能力和金银花绿原酸高剂量组脑组织中LXA4含量明显升高,脑组织中β-分泌酶、γ-分泌酶、AchE含量明显降低,且β-分泌酶、γ-分泌酶含量能恢复至与正常组相当的水平,血糖、血脂、尿酸、肝肾功能指标均明显改善。由此推测金银花绿原酸改善铝染毒致AD小鼠学习记忆能力障碍的机制可能是通过调控相关分泌酶、LXA4和各生化指标而实现的。

利益冲突：所有作者均声明不存在利益冲突。