基于网络药理学探讨甘草泻心汤治疗白塞病的作用机制

宋书珍，王旭光，宋世娜，孙万晶，胡国冰*

德州市人民医院，1 药剂科，2 中医科，德州 253000

白塞病（Behcet's disease，BD）是一种系统性炎症疾病，以非特异性血管炎为主要病理损害［1］。临床以复发性口腔溃疡、生殖器溃疡、皮肤损害及眼部虹膜炎为主要特征，也可累及血管、神经、心、肺、肾等全身多个组织/器官［2］。由于BD 临床表现多样，极易造成漏诊和误诊。当BD 累及血管、神经、眼部等时，不仅诊断和治疗的难度较大，其致残率和致死率也较高。然而，目前临床尚无有效的治疗方法。西医多依赖于生物制剂、免疫抑制剂和激素等控制患者的病情，但不良反应较大，且停药后患者易复发［3］。近年来，中医药在治疗BD 方面发挥了较好的优势。研究表明［4］，中药或中西医结合治疗BD 可提高治疗总有效率、降低复发率。

甘草泻心汤源于《伤寒论》，由炙甘草四两、黄芩三两、干姜三两、半夏（洗）半升、大枣（擘）十二枚和黄连一两组成［5］。中医学认为，BD 属于“狐惑病”范畴。“狐惑”作为中医病名，首见于《金匮要略·百合狐惑阴阳毒病脉证治第三》：“狐惑之为病，状如伤寒，默默欲眠，目不得闭，卧起不安，蚀于喉为惑，蚀于阴为狐，不欲饮食，恶闻食臭，其面乍赤、乍黑、乍白，蚀于上部则声喝，甘草泻心汤主之”［6］。《金匮要略》中甘草采用生甘草，其清热解毒力盛［7］。湿热毒瘀互结为BD 发病的病理基础，并贯穿该病始终［8］。因此，本研究中甘草采用生甘草。研究证实甘草泻心汤治疗BD疗效确切［9-10］。然而，甘草泻心汤的活性成分复杂。因此，甘草泻心汤的作用机制研究具有较大的难度，且目前尚无甘草泻心汤治疗BD 的机制研究。

网络药理学是一门新兴学科，通过系统药理学、分子生物学和计算机网络等方式从系统层次和生物网络的整体角度出发，解析药物与疾病之间的分子关联规律，为中药复杂体系研究提供了新思路，为临床合理用药、新药研发等提供了新的科技支撑［11］。本研究通过网络药理学探索甘草泻心汤的有效活性成分和BD 的潜在治疗靶点，以期为甘草泻心汤治疗BD 的后续深入研究提供理论依据。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 甘草泻心汤活性成分及对应靶点筛选

通过中药系统药理学数据库与分析平台（Traditional Chinese Medicine Systems Pharmacology Database and Analysis Platform，TCMSP，http：//tcmspw.com/tcmsp.php），以“半夏”“干姜”“黄芩”“甘草”“大枣”“黄连”为关键词，检索甘草泻心汤中所有活性成分，根据各成分的代谢、吸收、分布、排泄等药动学参数以及口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%、药物相似度（drug-likeness，DL）≥0.18，筛选并获取每味中药的活性成分及对应靶点。

1.2 BD 相关靶点获取

以“Behcet's disease”为检索词，通过人类基因综合分析数据库（ GeneCards，http：//www.genecards.org）、在线人类孟德尔遗传数据库（OMIM，https：//omim.org）、遗传药理学和药物基因组学数据库 （PharmGKB，https：//www.pharmgkb.org）、生物信息学和化学信息学数据库（DrugBank，https：//go.drugbank.com/） 收 集BD 相关靶点。运用R 4.1.0 软件提取GeneCard、OMIM、PharmGkb 及DrugBank 数据库中的所有靶点，所得并集即为BD 相关靶点。

1.3 甘草泻心汤治疗BD 的网络可视化分析

将筛选的甘草泻心汤活性成分靶点与BD 相关靶点取交集，分别导入Cytoscape 3.8.2 软件中，构建药物-疾病靶点相互作用网络。通过基因/蛋白质相互作用检索工具（ STRING 11.5，https：//stringdb.org）数据库（最低要求交互得分＞0.40，并隐藏网络中断开连接的节点），构建蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction，PPI）网络，并导入 Cytoscape 3.8.2 软件中，运用CytoNCA插件，以度中心性（degree centrality，DC）、介数中心性（betweenness centrality，BC）、接近中心性（closeness centrality，CC）、特征向量中心性（eigenvector centrality，EC）、网络中心性（network centrality，NC）和局部边连通性（local average connectivity-based method，LAC）为筛选条件，选择大于中位值的数据，经2 次筛选后得到甘草泻心汤治疗BD 的核心靶点。

1.4 基因本体论（gene ontology，GO）及京都基因和基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）分析

分别通过R 4.1.0 软件和OmicShare 平台（https：//www.omicshare.com/tools/）对甘草泻心汤活性成分-BD 进行GO 和KEGG 富集分析，并将结果进行可视化处理。

2 结果

2.1 甘草泻心汤中活性成分和对应靶点筛选

截至2021 年11 月，在 TCMSP 数据库中筛选出甘草活性成分92 个，半夏活性成分13 个，干姜活性成分5 个，黄芩活性成分36 个，大枣活性成分29 个，黄连活性成分14 个，共189 个活性成分，去掉重复活性成分后共174 个。此外，174 个活性成分对应靶点共3225 个，去掉重复靶点，得到甘草泻心汤靶点共247 个。

2.2 甘草泻心汤活性成分靶点与BD 相关靶点交集

应用Genecard、OMIM、PharmGkb、DrugBank 4 个数据库检索并取交集，共得到1006 个BD 相关靶点（图1）。对药物有效成分靶点与BD 相关靶点取交集，共得到60 个交集靶点（图2）。

图1 BD 靶点整合

图2 甘草泻心汤活性成分与BD 交集靶点韦恩图

2.3 甘草泻心汤活性成分-BD 靶点网络构建

将所得的甘草泻心汤活性成分靶点及交集靶点导入 Cytoscape 3.8.2 软件中，构建甘草泻心汤活性成分-BD 靶点相互作用网络（图3）。通过CytoNCA 插件分析网络关系中DC≥10 的活性成分，发现甘草泻心汤中与BD 关系最为密切的活性成分为槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、β-胡萝卜素、刺槐素（表1）。

表1 甘草泻心汤的主要活性成分

图3 甘草泻心汤活性成分-BD 靶点相互作用网络

2.4 PPI 网络构建

设置交互得分＞0.40，得到 PPI 网络（图4）。包含57 个节点，726 条边，平均DC 为25.5。将互作网络关系导入Cytoscape 3.8.2 软件中，筛选得到甘草泻心汤治疗BD 核心靶点20 个，包括HMOX1、IFNG、CAT、EGF、VEGFA、PTGS2、CXCL8、TP53、IL1B、STAT3、SERPINE1、MPO、CCL2、SELE、ICAM1、VCAM1、MMP9、CASP3、NFKBIA、IL1A（图5 和表2）。提示这些蛋白可能是甘草泻心汤治疗BD 的关键靶点。

表2 甘草泻心汤治疗BD 的核心靶点

图4 甘草泻心汤治疗BD 靶点PPI 网络

图5 甘草泻心汤治疗BD 的核心靶点PPI 网络

2.5 GO 富集分析及 KEGG 通路分析

应用R 4.1.0 软件进行GO 富集分析，得到条目共1697 个，其中生物过程（biological process，BP）1561 个， 细胞组分（cellular component，CC）26 个，分子功能（molecular function，MF）110 个，并对Q值排序后前 10 名进行分析（图6）。甘草泻心汤活性成分治疗BD 的相关靶点主要涉及对脂多糖的反应、对细菌来源的分子反应、外源性凋亡信号通路、负向调节凋亡信号通路、负向调节外源性凋亡信号通路、活性氧的代谢过程、对药物的反应、细胞对生物刺激的反应等生物过程；细胞组分分析表明，靶点主要与膜筏、膜微域、陷窝、囊腔、细胞质膜筏、细胞质囊腔、分泌颗粒内腔、细胞器外膜等组分有关；分子功能分析表明，靶点主要涉及血红素结合、细胞因子受体结合、细胞因子活性、氧化还原酶活性、受体配体活性、信号受体激活因子活性、单加氧酶活性等，提示甘草泻心汤可通过参与这些过程来发挥治疗作用。

图6 GO 富集分析柱状图（排名前10 位）

2.6 KEGG 信号通路富集分析结果

应用OmicShare 平台对共同靶点进行 KEGG信号通路富集，Q值≤0.05 的富集结果共114 个，主要涉及血液流变学、病毒感染、炎症因子、免疫调节等。对Q值排序后前20 名进行分析（图7）。KEGG 富集最显著的10 条通路分别为糖尿病并发症AGE-RAG 信号通路（AGE-RAGE signaling pathway in diabetic complications）、流体剪切应力与动脉粥样硬化通路（fluid shear stress and atherosclerosis）、肿瘤坏死因子信号通路（TNF signaling pathway）、 肿瘤通路（pathways in cancer）、白介素-17 信号通路（IL-17 signaling pathway）、麻疹通路（measles）、甲型流感通路（influenza A）、丙肝通路（hepatitis C）、恰加斯病通路（chagas disease）、弓形体病通路（toxoplasmosis）。这些结果提示甘草泻心汤可能通过抑制炎性反应、调节内分泌水平、抗病毒及调控恶性肿瘤中蛋白多糖信号通路等方面发挥治疗作用。

图7 KEGG 信号通路富集结果（排名前20 位）

3 讨论

甘草泻心汤具有益气和胃、消痞止痢、调和寒热的功效，对治疗BD 具有较好的临床疗效。国明俊等［12］运用甘草泻心汤治疗27 名BD 患者，3 个疗程后共治愈26 例，治愈率达96.3%。此外，未治愈1 例，经中西医结合治疗后痊愈。半年内未复发，半年后复发5 例，且经治疗后痊愈。本研究通过数据库共检索到甘草泻心汤中主要活性成分174 个，其中槲皮素、山柰酚、汉黄芩素、黄芩素、β-胡萝卜素、刺槐素可能是治疗BD 的主要活性成分。药理研究发现［13-15］，槲皮素属于黄酮类化合物，大量存在于蔬菜、水果以及中草药中，具有抗炎、抗氧化等作用，可有效减轻葡萄膜炎［16］。此外，山柰酚［17］、汉黄芩素［18］、黄芩素［19］、β-胡萝卜素［20］、刺槐素［21］也具有抗炎、抗氧化、清除氧自由基等药理活性，对于BD 所致的器官损害具有治疗潜力。

本研究中，甘草泻心汤治疗BD 的PPI 网络分析得到HMOX1、IFNG、CAT、EGF、VEGFA、PTGS2、CXCL8、TP53、IL1B、STAT3、SERPINE1、MPO、CCL2、SELE、ICAM1、VCAM1、MMP9、CASP3、NFKBIA、IL1A 等核心靶点，蛋白类型涉及趋化因子、血管生成因子、过氧化氢酶等。IFNG基因编码一种可溶性细胞因子，为 Ⅱ型干扰素类的成员，其突变与病毒、细菌和寄生虫感染以及几种自身免疫性疾病的易感性增加有关［22-23］。STAT3基因可在调节宿主对病毒和细菌感染的反应中发挥作用，该基因的突变与多系统自身免疫疾病有关［24］。研究表明［25］，CAT基因可在体内发挥抗氧化作用，对维持氧化-抗氧化平衡至关重要。VEGFA 是一种具有促进血管内皮细胞增殖作用的细胞因子，其可激活胞外信号调节激 酶（extracellular signal-regulated kinase，ERK）信号通路，促进血管细胞的生长、增殖［26］。表皮生长因子（epidermal growth factor，EGF）具有促进表皮生长、增加细胞再生能力的作用［27］。刘洋等［28］通过建立大鼠胃溃疡模型，发现甘草泻心汤可减轻乙酸型胃溃疡大鼠的胃黏膜损伤，这可能是通过升高EGF 和前列腺素E2，降低胃蛋白酶活性、抑制胃泌素分泌而发挥作用。以上结果在一定程度上证实了PPI 网络分析核心靶点的可靠性，提示其可为进一步研究甘草泻心汤治疗BD 的机制研究提供思路。

GO 富集分析结果表明甘草泻心汤主要通过活性氧代谢、药物代谢、细胞对生物刺激的反应、免疫炎症反应等生物过程影响疾病病理过程。KEGG信号通路富集分析结果显示，甘草泻心汤治疗BD可能通过参与糖尿病并发症 AGE-RAGE 信号通路、流体剪切应力与动脉粥样硬化信号通路、IL-17 信号通路、丙肝病毒信号通路以及TNF 信号通路等。王国庆等［29］研究发现甘草泻心汤可使溃疡性结肠炎患者的IL-17、IL-23 表达水平下调。陈浩等［30］研究发现在溃疡性结肠炎患者中，与单纯美沙拉嗪治疗相比，美沙拉嗪联合甘草泻心汤进一步降低了患者TNF-α、IL-8、IL-17、IL-23 的表达水平。这些研究结果在一定程度上与本研究结果相一致。

综上所述，本研究从网络药理学角度系统分析了甘草泻心汤治疗BD 的分子机制，共获得174 个活性成分，60 个靶点，表明甘草泻心汤可通过多靶点、多通路治疗BD，为深入揭示其作用机制提供了生物信息学基础。