应用二代测序技术检测73例骨髓增生异常综合征患者基因突变的结果及其临床特征与预后关系的研究

王利萍 李凤丽 汪安友 王兴兵 刘 欣

中国科学技术大学附属第一医院 安徽省立医院血液科，安徽 合肥 230001

骨髓增生异常综合征（myelodysplastic syndromes，MDS）是一组起源于造血干细胞的异质性髓系克隆性疾病，其特点是髓系细胞发育异常，表现为无效造血、难治性血细胞减少，高风险向急性髓系白血病（acute myeloid leukemia，AML）转化[1]。MDS 在老年患者中发病率高，在当今人口老龄化的背景下，MDS 的发病率在未来将会大幅度增加，因此，准确的诊断和评估疾病的进展风险是必要的[2]。通过二代测序（second generation sequencing，NGS）评估临床重要突变是定义诊断、确定预后风险、监测可测量的残留疾病和揭示预测性突变标记物及治疗靶点的强大工具，是血液疾病检查和监测的常规组成部分，基因组学已经成为诊断检查的标准组成部分，并成为决策的关键因素[3]。很多突变基因是影响MDS 患者总生存期（overall survival，OS）变化独立因素。NGS 使得MDS 的基因突变谱系更加清晰明了，但涉及基因突变在MDS 发生、发展及演变中的具体分子及其作用机制时，临床尚知之甚少，这一现状一定程度上阻碍了NGS 在临床实践中的具体应用。另一方面，虽然目前已经研发出许多针对突变基因的分子靶向药物，但这些药物中的大多数尚处于Ⅰ、Ⅱ期临床试验阶段，并未真正用于临床治疗实践中，至于其最终临床疗效及改善程度如何，尚有待进一步验证[4]。本研究回顾性分析73 例MDS 患者的基因突变与临床特征及生存预后的相关性，从而对MDS 的基础研究、诊断、精准治疗及预后评估提供更多理论支持。

1 资料与方法

1.1 一般资料

回顾性分析2016 年4 月至2022 年6 月在安徽省立医院（本院）行NGS 检测基因突变的初诊并接受治疗的73 例MDS 患者。本研究经本院医学伦理委员会批准。纳入标准：①根据WHO（2016 年）诊断分型与血液病诊断及疗效标准的诊断标准[5]，收集所有患者的骨髓细胞形态、染色体核型、融合基因和免疫表型等数据结果来加以确诊；②确诊后在本院行NGS 检测基因突变的患者；③临床数据及随访资料完整者；④年龄>14 岁者。排除标准：①既往在外院诊断治疗，缺乏完整临床资料者；②未进行NGS 检测基因突变者。③除MDS外存在其他恶性肿瘤及血液系统疾病者；④继发性MDS 患者。

1.2 NGS检测

选择患者两侧髂后上棘或髂前上棘穿刺部位，行骨髓穿刺，并采集骨髓标本（3 ml），抗凝管保存并送检行骨髓涂片检查、染色体核型分析及NGS 检测基因突变等。运用illumina 测序仪对标本进行高通量测序，即可得到测序后的结果。骨髓标本由本院研究中心检验完成。

1.3 临床数据收集

收集患者的性别、年龄、WHO（2016）分型、危险度分层（revised international prognostic scoring system，IPSS-R）、染色体核型分析、基因突变、患者生存状态、生存时间等数据资料。

1.4 统计学处理

采用SPSS 26.0 统计学软件进行数据分析，非正态分布计量资料以[M（P25，P75）]表示，采用Mann-WhitneyU检验和Kruskal-WallisH检验，计数资料以[n（%）]表示，采用χ2检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 基因突变特征

本研究共检测到29 种基因突变，其中58 例（79.45%）患者有基因突变，15 例（20.55%）患者无基因突变。22 例（30.14%）患者仅发生1 个基因突变，16 例（21.92%）患者发生2 个基因突变，20 例（27.40%）患者发生3 个及3 个以上基因突变，突变基因频率大于5%的依次为：ASXL1、TP53、TET2、U2AF1、DNMT3A、SF3B1、SRSF2、RUNX1、IDH1、ETV6、WT1。见表1 ～2。

表1 各突变基因频数及频率

表2 突变基因数目的例数及占比

2.2 基因突变与各因素分析

对突变频率较高的基因做与性别、年龄、分型、分层、核型等因素的分析，不同性别的突变基因比较，差异无统计学意义（P> 0.05）。TP53（P=0.030）、TET2（P< 0.001）、SRSF2（P=0.027）突变基因均在老年MDS 患者中发生率较高，差异有统计学意义（P< 0.05）。DNMT3A（P=0.034）、SF3B1（P=0.002）、IDH1（P=0.017）、WT1（P=0.017）突变基因在各WHO（2016）分型之间分布差异有统计学意义（P< 0.05）。各个突变基因在不同危险度分层频率分布差异无统计学意义（P> 0.05）。TP53、U2AF1突变基因在不同染色体核型分布差异有统计学意义（P< 0.05）。见表3 ～7。

表3 突变基因与性别的关系

表4 突变基因与年龄的关系

表5 突变基因与WHO（2016）分型的关系

表6 突变基因与危险度分层的关系

表7 突变基因与染色体核型的关系

2.3 基因突变与OS及预后意义

采用Kaplan-Meier 曲线对基因突变频率较高的突变基因做与OS 的相关性分析发现，TP53 突变与预后不良相关，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表8。

表8 突变基因与OS的关系

3 讨论

基因突变在MDS 的发生、发展中扮演着极其重要的作用。随着NGS 技术的广泛应用，越来越多突变基因被发现，进一步完善了血液恶性肿瘤疾病的基因突变谱。本研究分析包括MDS 患者中常见基因突变与性别、年龄、染色体核型、WHO（2016）分型、IPSS-R 危险度分层等临床特征的相关性，并分析各基因突变与OS 的关系及其对评估MDS 患者预后、指导治疗的作用。

本研究结果发现，其中79.50%的患者至少发生1 个基因突变，21.92%的患者发生2 个基因突变，27.40%的患者发生3 个及以上基因突变。其中突变基因频率最高的是ASXL1（27.40%），余下突变依次为TP53、TET2、U2AF1、DNMT3A、SF3B1、SRSF2、RUNX1、IDH1、ETV6、WT1，这些突变基因与以往相关文献研究的常见突变基因基本一致，Haferlach等[6]筛查了944例MDS患者的104个基因，其中845（89.50%）例MDS 患者检测出至少一种基因突变，其中突变频率较高的有TET2、SF3B1、ASXL1、SRSF2、DNMT3A 和RUNX1 等。一项研究[7]纳入了2043 例MDS 患者，其中1630 例（80%）患者出现一个或多个突变。各突变基因在不同年龄患者中的分布有差异，其中TP53、TET2、SRSF2 在老年MDS 患者中发生率较高，差异有统计学意义（P< 0.05）。在突变基因分布与WHO（2016）分型的关系中分析发现，DNMT3A、SF3B1、IDH1、WT1 突变基因在各分型之间分布差异有统计学意义（P< 0.05）。SF3B1 主要分布在MDS-RS 中，这一分析发现与既往文献研究发现SF3B1 突变与MDS 亚型之间有明确的联系，MDS 伴环形铁粒母细胞（MDS-RS）和单系或多系发育不良（MDS-RS-SLD，MDS-RS-MLD）[8]结果一致，且SF3B1 作为MDS-RS 特征性分子生物学标志，已纳入MDS-RS 的诊断标准中。有相关研究发现SF3B1 与较低的骨髓细胞百分比、较高的白细胞计数和较高的中性粒细胞计数、较高的中位血小板计数之间存在关联[9]。根据危险分层不同，发现各突变基因频率分布差异无统计学意义（P> 0.05）。虽然既往多次研究及相关专家共识表明基因突变和危险度评分均能作为评估患者预后的一项重要指标，但本研究结果未发现两者之间的联系，有待于进一步研究。临床上发现有部分患者的实际预后与其风险评分不一致，这可以用体细胞突变来解释，例如，来那度胺用于治疗低风险的del（5q）患者，结果反应良好，且低风险的del（5q）患者进展为AML 的频率较低[10-11]。虽然修订后的国际预后评分系统的引入提高了临床预测MDS 患者预后的能力，就目前的MDS 评分系统而言，其基于疾病特异性因素，包括细胞计数、细胞减少程度、输血依赖和细胞遗传学，未考虑其他患者相关因素，如共病、虚弱和性能状态[12]。随着越来越多的研究探索突变状态在预后评分中的效用，如何调整IPSS-R 以结合遗传信息和复合突变MDS 的生物学复杂性将变得越来越清楚。

本研究发现TP53 突变是OS 的独立不良预后因素，除TP53 突变外，国内外专家共识及多个文献报道许多基因都与预后相关，本研究发现的突变频率较高的有：ASXL1、TET2、U2AF1、DNMT3A、SF3B1、SRSF2、RUNX1，早在2011 年，Thol 等[13]直接测序了193 例MDS 患者的DNA 中是否存在ASXL1 突变，并评估了它们对预后的影响，从单因素分析结果中发现，ASXL1 突变患者的OS 明显短于野生型ASXL1 患者，且ASXL1 突变与中等风险核型相关，但与其他临床参数无关。一项荟萃分析显示ASXL1 突变与MDS 的不良预后相关，这可能有助于该疾病的风险分层和预后评估[14]。Idossa 等[15]研究发现MDS 中的ASXL1 突变预示着去甲基化药物和来那度胺治疗的不良反应。Walter 等[16]通过对151 例MDS 患者的研究发现，与无DNMT3A突变的患者相比，DNMT3A 突变患者的OS 更差（P=0.005），且更快速的进展为AML（P=0.007），这表明DNMT3A 突变患者的突变状态可能对早期MDS 有预后价值。一项研究[17]生存时间相关因素的报道表明，正常核型与较高的缓解率和较长的生存期相关，另有一项[18]多变量分析表明，复杂的细胞遗传畸变以及简单和复杂易位与不良预后独立相关。大约50%的MDS 患者具有正常的细胞遗传学，与AML 相比，MDS 中平衡结构异常，如易位和倒置，在MDS 中相对罕见[19]。

综上所述，本研究利用NGS 技术分析了MDS患者的基因突变情况，并分析描述基因突变在不同临床特征中的分布特点及与OS 的相关性。但是本研究存在样本数量相对较少和随访时间较短等局限性。部分MDS 患者存在共突变、联合突变等，其预后意义有着更高的价值，本研究未能进行充分的分析，有待进一步对基因及联合基因突变进行描绘及预后追踪，了解突变基因更为确切的临床意义，更好地进行疗效预测、预后评估，而治疗方面，具有显著性改变MDS 患者预后倾向的新型治疗药物的开发落后于许多其他血液肿瘤疾病。对于MDS 来说，真正的精准医疗仍在未来。