肺祖细胞抑制博来霉素诱导的小鼠肺纤维化

陈 佳 黄燕霞 冯玉丽 刘贝珠

广州市番禺区何贤纪念医院，广东 广州 511400

肺纤维化（pulmonary fibrosis，PF）是一种慢性、进行性的肺部疾病，目前几乎没有治愈的方法，而且预后不良[1]。肺泡上皮的损伤和再生能力下降是肺纤维化的机制之一[2]。本研究通过体外诱导人胚胎干细胞（human embryonic stem cell，HESC）分化为肺祖细胞（lung progenitor cells，LPC），移植至健康及博来霉素诱导PF 的免疫缺陷小鼠体内，发现LPC 可以在小鼠体内长期存活并抑制PF 的程度。在PF 小鼠中，LPC 可以降低α-平滑肌肌动蛋白（α-smooth muscle actin，α-SMA）和细胞外基质蛋白-1（extracellular matrix protein 1，ECM-1）的表达，同时抑制细胞凋亡。但未找到LPC 在体内表达表面活性物质C（surfactant associated protein C，SPC），分化为肺泡上皮的证据。本研究提示LPC 可以抑制小鼠PF 的程度，为PF 的治疗提供一种可行的策略。

1 材料与方法

1.1 材料

NCG（NOD/ShiLtJGpt-Prkdcem26Cd52IL2rgem26Cd22/Gpt）小鼠购自江苏集萃药康生物科技有限公司，雌性，6 ～8 周龄。4%多聚甲醛固定液、免疫染色强力通透液、凋亡检测试剂盒和Triton X-100 购自碧云天。人胚胎干细胞H9 系（HES H9）购自广州徕智生物科技有限公司。DMEM 培养基、F-12 培养基购自Gibco公司。mTeSR1 干细胞培养基、ReLeSRTM 和StemDiff Definitive Endoderm Kit 购自StemCell Technologies 公司。苏木精-伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色试剂盒、Masson 染色试剂盒、细胞膜橙色荧光探针（1，1’-dioctadecyl-3，3，3’，3’-tetramethylindocarbocyanine perchlorate，DiI）和羟脯氨酸（hydroxyproline，HYP）检测试剂盒购自索莱宝。防荧光淬灭封片剂（含DAPI）购自白鲨易。

1.2 HES H9体外培养并分化为LPC

HES H9 细胞体外培养并分化为LPC，培养方法参考StemCell Technologies 公司技术手册，分化方案参考Hawkins 等[3]和Peng 等[4]的方法。

1.3 NCG小鼠肺纤维化造模及分组

NCG 小鼠随机分为对照组10 只、造模组20 只和治疗组20 只。对照组只通过气管灌注LPC[1×106个细胞/只，重悬于40 μl 磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline，PBS）]；造模组通过气管灌注博来霉素（2 μg/10 g）；治疗组气管灌注博来霉素（2 μg/10 g）后2 周再灌注LPC（1×106个细胞/只，重悬于40 μl PBS）。LPC 移植前使用DiI细胞膜橙色荧光探针标记。小鼠每2 天记录体重，4 周后牺牲，取肺组织进行冰冻切片，检测α-SMA、ECM-1 的表达，肺细胞凋亡和LPC 分化为SPC 成熟肺上皮的情况。病理切片进行HE、Masson 染色，并检测HYP 的表达。

1.4 相关指标检测方法

1.4.1 胚胎分化各阶段免疫荧光和细胞流式术 各阶段细胞提前接种于共聚焦培养皿，去除培养基，用PBS 清洗2 次，固定10 min，破膜5 min。使用叉头框转录因子A2（forkhead box transcription factor A2，FOXA2）和甲状腺转录因子-1（thyroid transcription factor-1，TTF-1/NKX2.1）抗体进行孵育，二抗孵育后加入DAPI 防荧光淬灭剂，使用共聚焦显微镜拍照记录。细胞流式术处理基本同免疫荧光，处理完毕后上机。DE 阶段使用流式检测趋化因子受体4（chemokine receptor-4，CXCR4）和免疫荧光检测FOXA2 评估分化率。LPC 阶段使用流式检测和免疫荧光检测NKX2.1 评估分化率。

1.4.2 肺组织的冰冻切片免疫荧光 处死小鼠后剪开胸腔，暴露肺和心脏，剪开左心耳，从右心室注射冰冻PBS 灌洗肺部，减少红细胞影响。分离肺组织后固定24 h，脱水24 h。肺组织包埋后，-80℃冰冻2 h 后进行切片。切片解冻后破膜处理，洗涤后使用免疫组化笔标记组织区域。对照组孵育SPC 抗体，造模组和治疗组孵育α-SMA 和ECM-1 抗体。使用共聚焦显微镜拍照记录，使用凋亡检测试剂盒检测细胞凋亡情况。每个切片随机选取3 个视野（放大倍数为400 倍）。阳性面积为荧光面积占所检查的总组织面积的百分比（%Pixel）。

1.4.3 肺组织的石蜡切片HE 和Masson 染色 小鼠肺部取材方法同冰冻切片。取得小鼠肺部组织后使用4%多聚甲醛固定液浸泡48 h，使用全自动脱水机脱水处理后石蜡包埋。石蜡切片经二甲苯脱蜡后，使用HE 染色试剂盒、Masson 染色试剂盒染色。树漆封片后在光学显微镜下拍照记录。使用Ashcroft score 评估肺纤维化程度，分为0 ～8 个等级，其中0 表示无纤维化，8 表示最严重的纤维化。每个切片随机选取3 个视野（放大倍数为100 倍）。

1.4.4 肺组织HYP 含量测定 取0.2 g 小鼠肺部置于2 ml EP 管中，剪碎，加入1.5 ml 的6 mol/L 的盐酸溶液，置于煮沸的水浴锅中3 h。12 000 g 离心10 min，取上清液待测。按照HYP 检测试剂盒说明书制订标准曲线以及加入相关试剂。测定吸光度，计算HYP 含量。

1.5 统计学处理

使用SPSS 24.0 统计学软件进行数据处理。计量资料用均数±标准差（±s）表示，行方差齐性检验。多组间比较采用单因素方差分析，组间两两比较采用LSD-t检验。图片采用Image J 处理，图表采用GraphPad Prism 制作。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 LPC体外分化以及在NCG小鼠体内定植情况

HES H9 在体外分化为LPC 是需要经过DE 阶段，此阶段的标志物为FOXA2 和CXCR4，免疫荧光和细胞流式术显示，FOXA2 和CXCR4 的表达率能达到90%。而LPC 的主要标志物为NKX2.1，免疫荧光和细胞流式术显示，LPC 的分化效率为70%（图1A ～D）。将LPC 分别移植至对照组NCG 小鼠及造模组肺纤维化NCG 小鼠肺后4 周取材，通过冰冻切片依旧能找到预染Dil 染料LPC，提示LPC 能在正常肺部和纤维化肺部定植（图1E ～F）。但通过免疫荧光染色，发现LPC 细胞并不表达成熟肺上皮的标志物SPC，提示LPC 只能在肺内定植，但不能分化为成熟肺上皮。

图1 LPC 体外分化以及在NCG 小鼠体内定植情况（n ≥10）

2.2 LPC对肺纤维化NCG小鼠肺部结构影响

HE 染色和Masson 染色结果显示，与对照组的肺组织相比，造模组出现了明显的肺纤维化，肺泡正常结构被破坏，取而代之的是致密的胶原组织。而治疗组与造模组肺纤维化程度相比明显减轻，但与对照组相比，仍然有一定程度的肺纤维化（图2A ～B）。对照组、造模组、治疗组反映肺纤维化程度的Ashcroft score 分别为（2.79±0.18）、（6.25±0.30）、（3.94±0.11），各组之间的差异有统计学意义（图2C，F=1009.559，P=0.000）。

图2 LPC 对肺纤维化NCG 小鼠体重及肺部结构影响（n ≥10）

2.3 LPC对肺纤维化NCG小鼠α-SMA、ECM-1和SPC表达的影响

α-SMA 和ECM-1 是肺纤维化组织的主要成分，也是反映纤维化严重程度的指标[5]。通过肺组织的冰冻切片，行免疫荧光观察上述成分的表达量，通过计算荧光面积，从而对其进行半定量评估。结果显示在灌注LPC 后，治疗组α-SMA 和ECM-1 表达量均比造模组低，但不能低至与对照组相似水平（图3A ～B）。对照组、造模组、治疗组α-SMA 荧光面积分别为（1.19±0.15）、（13.50±0.65）、（2.34±0.06）%Pixel，各组之间的差异有统计学意义（F=4553.080，P=0.000）；ECM-1 荧光面积分别为（0.77±0.11）、（23.50±0.65）、（1.34±0.07）%Pixel，各组之间的差异有统计学意义（F=17123.305，P=0.000）。SPC 为Ⅱ型肺泡上皮分泌的蛋白，能反映肺上皮的功能[6]，结果显示在灌注LPC 后，治疗组SPC 表达量比造模组高，提示肺上皮功能有所恢复，但不能恢复与对照组相似水平（图3C）。对照组、造模组、治疗组SPC 荧光面积分别为（24.90±1.03）、（4.38±0.15）、（13.90±0.49）%Pixel，各组之间的差异有统计学意义（F=4677.085，P=0.000）。

图3 LPC 对肺纤维化NCG 小鼠α-SMA、ECM-1 和SPC 表达的影响（n ≥10）

2.4 LPC对肺纤维化NCG小鼠羟脯氨酸（HYP）表达量和细胞凋亡的影响

HYP 是胶原特有的氨基酸，其含量直接反映胶原水平的高低[7]。与对照组比较，造模组HYP含量显著升高，经过LPC 灌注治疗后，HYP 水平下降，但不能降至正常水平（图4A）。对照组、造模组、治疗组HYP 浓度分别为（346.20±10.18）、（705.20±32.72）、（442.30±12.11）μg/mg，各组之间的差异有统计学意义（F=1079.647，P=0.000）。而反映细胞凋亡的原位末端转移酶标记技术（TdTmediated-dUTP nick end labeling，TUNEL）染色实验中，造模组细胞凋亡水平明显高于其他组，对照组、造模组、治疗组荧光面积分别为（1.94±0.22）、（31.90±1.70）、（4.83±0.22）%Pixel，各组之间的差异有统计学意义（图4B，F=3962.008，P=0.000）。

图4 LPC 对肺纤维化NCG 小鼠HYP 表达量和细胞凋亡的影响（n ≥10）

3 讨论

间充质干细胞和胚胎干细胞在肺纤维化治疗方面取得了显著的进展，许多研究表明它们可以减轻肺纤维化的程度[8-9]。然而，这些研究大多数显示间充质干细胞无法替代和修复受损的上皮细胞[10]，而直接移植胚胎干细胞则存在形成畸胎瘤的风险[11]。为了解决这些问题，本研究将胚胎干细胞分化为肺系祖细胞，减少畸胎瘤形成的风险，并采用同系的细胞进行移植，以期望实现原位修复，为临床应用提供实验室支持。通过在实验室中进行此项研究，为肺纤维化的治疗提供了一种新的方法。然而，尽管本研究在实验室环境中取得了一定的成功，但在临床应用中仍需进一步的研究和验证。

目前，关于使用LPC 移植治疗肺疾病的研究较少，主要是因为LPC 的诱导和产量存在困难[12-13]。最近，一种商业方案出现，可以从HT2 阳性肺细胞中提取并诱导成成熟的肺上皮细胞[14]。本研究采用了一种从胚胎干细胞开始的LPC 诱导方案，该方案成熟且产量较大，适用于移植研究。有研究发现[15]，移植的LPC 能在肺中存活4 周的时间，但不能分化为能够分泌SPC 的成熟肺上皮细胞，可能与缺乏分化因子和适宜的微环境有关。这一发现表明，LPC 可能通过旁分泌的方式缓解肺纤维化，而不是通过分化成成熟的上皮细胞替代原受损细胞。LPC 更接近于肺系细胞，可能具有更好的组织相容性。尽管本研究为LPC 在肺纤维化治疗中提供了理论基础，但仍需要进一步研究LPC 的分化机制和提高治疗效果的方法，特别是解决LPC 分化受限的问题，需要探索提供适宜的分化因子和微环境的策略。

本研究结果显示，治疗组的细胞凋亡率较低，同时治疗组中纤维化水平的代表性蛋白α-SMA、ECM-1 和HYP 的表达显著增加。此外，代表肺上皮细胞功能的蛋白SPC 在治疗组中也呈现出恢复的趋势。研究结果表明低剂量肺上皮细胞（LPC）可能通过旁分泌途径减少细胞凋亡，从而降低α-SMA、ECM-1 和HYP 的水平，保护肺上皮细胞，并达到缓解肺纤维化的目的。这些发现为干细胞转化医学领域提供了实验基础，为进一步研究LPC 在缓解肺纤维化中的作用提供了依据。然而，LPC 在体内未能成功分化为肺上皮细胞，无法替代受损的肺上皮细胞。为了克服这一局限性，可以考虑在体外继续将LPC 分化为上皮细胞，然后再进行体内移植。这种方法可能有助于突破LPC 无法替代原生肺上皮细胞的限制，并进一步提高其在肺纤维化治疗中的效果。然而，这一策略的实施需要更多的实验和临床研究来验证其可行性和安全性。

综上所述，本研究结果揭示了LPC 在减少细胞凋亡、降低纤维化指标蛋白水平、保护肺上皮细胞以及缓解肺纤维化方面的潜力。然而，进一步的研究仍需要探索LPC 的分化机制以及提高其在治疗肺纤维化中的效果的方法。这将有助于推动干细胞转化医学的发展，并为肺纤维化患者提供更有效的治疗选择。