S100A12在小鼠脓毒症继发急性肺损伤的表达及功能研究

颜才荣 朱景法 康丽萍 陈伟文

1.福建医科大学附属泉州第一医院急诊科，福建 泉州 362200；2.福建医科大学附属泉州第一医院产科，福建 泉州 362200；3.福建医科大学附属泉州第一医院重症监护室，福建 泉州 362200

脓毒症（sepsis）是病原微生物感染机体导致的全身炎症反应综合征（systemic inflammatory response syndrome，SIRS），脓毒症患者病情发展到后期可能会引发脓毒症休克（septic shock）、多器官功能障碍综合征（multiple organ dysfunction syndrome，MODS）等多种情况，对患者的生命安全造成严重影响[1]。近年临床治疗水平在不断提升，但是全球老龄化程度加重等因素导致脓毒症的发病率仍旧呈现增高趋势[2-3]。S100 钙结合蛋白A12（S100 calcium binding protein A12，S100A12）是目前研究的一个重点，S100A12 与机体细胞增殖分化、炎症反应、钙离子稳态等都有一定的关系，研究结果显示S100A12可以通过参与多种信号通路调节对机体炎症反应产生作用。S100A12 当前主要是与自身免疫性疾病、肾病等疾病的研究相关，而与脓毒症等急性感染病症的相关研究相对较少。本文将研究S100A12在小鼠脓毒症继发急性肺损伤的表达及功能，探究S100A12 在小鼠脓毒症继发急性肺损伤中的作用和可能的作用机制。

1 材料与方法

1.1 实验动物分组

48 只雄性C57BL/6 小鼠（年龄7 ～8 周，体重20 ～25 g），随机分为两组：假手术（sham group，SHAM）组24 只、盲肠结扎穿孔（cecal ligation and puncture，CLP）组24 只。每组按实验后4、8、12、24 h 分为4 个时间点亚组，每亚组各6 只。小鼠在12 h 昼夜循环、22℃～25℃温度下饲养，可自由获得食物和水。实验动物许可证号：SCXK（豫）2019-0002。

1.2 小鼠脓毒症模型建立

通过参阅文献建立小鼠脓毒症模型，即采用CLP。小鼠禁食8 h，用1%戊巴比妥钠溶液（碧云天Beyotime，25 mg/kg，批号：S1872）腹腔内注射麻醉，常规手术消毒腹部，脱毛膏去掉右下腹部鼠毛。选择正中偏下位置切开小鼠腹部，打开小鼠腹腔寻找盲肠末端。将大肠系膜和盲肠分离，尽量避免伤害小鼠大肠组织。在小鼠盲肠尾端0.5 cm 处使用无菌丝线紧紧系上，在结扎的盲肠部位中央使用无菌针头刺穿，需要贯穿盲肠组织。结束后将小鼠盲肠回归原位，进行缝合。SHAM 组分离盲肠末端后，不进行结扎穿孔，直接关闭腹腔，逐层缝合。所有动物均在术后背后注射无菌磷酸盐缓冲液（PBS，国药集团化学试剂有限公司，批号：10016318）1 ml，行液体复苏治疗。整个实验过程在室温下进行，术后小鼠自由饮食、饮水。置于动物实验室内分笼饲养，每笼各6 只，记号分组。

1.3 小鼠处死及组织标本收集

在设定的目标时间点，即实验后4、8、12、24 h，用1%戊巴比妥钠溶液（25 mg/kg）腹腔内注射麻醉，将小鼠固定在鼠板上，沿胸腔中线剪开皮肤，接着剪断肋骨开胸，露出心脏，用注射器从心尖部进针，穿刺进入左心室后进行心脏取血（0.5 ml/只），将收集到的血液样本置于1.5 ml Ep 管中，室温静止2 ～4 h。血液中的血清析出之后，离心机设置4℃低温，500 g/10 min离心处理，将上层血清取出，放置在新的Ep 管中，12 800 g/10 min 继续离心处理。再次取血清，-80℃保存。

采血后在操作台上用剪刀将胸主动脉剪断，放血，将整个右肺用4 号丝线结扎，用剪刀剪下右上叶（右侧最大的肺叶），小心取出，置于无菌平皿中，用磷酸盐缓冲液冲洗后立即置液氮冻存，保存于-80 ℃液氮直至RNA 被提取；取右下肺叶用4%多聚甲醛（国药集团化学试剂有限公司，批号：100092683）固定24 h。SHAM 组小鼠在麻醉后，同样方法进行标本的采集。

1.4 酶联免疫吸附测定（enzyme-linked immunosorbnent assay，ELISA）法测定血清S100A12蛋白水平

阅读ELISA 法试剂盒（科艾博生物，批号：CB10001-Ra）说明书，按照步骤对微量反应板进行编号和分组（空白孔、标准孔和待测样品孔），经过洗涤、加抗体、加酶结合物、加底物、加终止液、测吸光值，最终绘制标准曲线图，根据曲线查出相应的浓度，再乘以稀释倍数即为S100A12 蛋白的实际浓度。

1.5 逆转录聚合酶链反应（reverse transcriptionpolymerase chain reaction，RT-PCR）法检测肺组织中S100A12、晚期糖基化终末产物受体（receptor for advanced glycation end products，RAGE）、核因子κB（nuclear factor kappa-B，NF-κB）的mRNA表达水平

提取肺组织总RNA，经过RNA 定量、cDNA 反转录，运用Light Cyler480 自带的软件进行实时数据收集和定量分析。

1.6 肺组织病理学观察及分析

小鼠相应时间点放血处死后，取右下肺叶用4% 多聚甲醛固定24 h，进行石蜡包埋、切片，苏木精- 伊红（hematoxylin-eosin，HE）染色，在普通光镜下观察：按Zegdi R 法对急性肺损伤进行评分，综合肺泡水肿、间质水肿、肺泡内白细胞聚集数量、出血、肺泡壁厚度等情况，把肺损伤程度分为5 级：0= 无损伤，1= 轻度损伤，2= 中度损伤，3=重度损伤，4=极重度损伤。并寻找合适的视野，拍照存档。

1.7 统计学方法

所有数据均由SPSS 26.0 统计学软件处理，不符合正态分布、方差齐性的计量资料采用[M（P25，P75）]表示，采用Mann-WhitneyU检验，多组相关数据之间的比较采用Friedman 秩和检验。P< 0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 一般资料

CLP 组小鼠在实验后4 h，活动度下降，呼吸频率加快，情绪不稳定，出现躁动、目光呆滞、精神不振等情况。在实验后12 h，小鼠症状加重，开始出现寒战、呼吸窘迫、对外界反应迟钝、活动不灵活等现象，口鼻眼角均有分泌物出现，停止进食。之后小鼠症状加重，有死亡情况出现。SHAM 组小鼠情况良好，呼吸、精神、进食情况良好，无明显分泌物，活动度高、无异常排泄物。

2.2 病理学观察及评分

2.2.1 标本肉眼观察 CLP 组小鼠肺部有淤血、肿胀表征，随着实验时间的加长，情况越发严重。小鼠肺部颜色偏向暗红，肺部表面有明显的出血点。SHAM 组小鼠肺部组织完整，表面无明显出血点，肺部色泽偏向红润，质地相对柔软。

2.2.2 HE 染色光镜下观察肺组织形态结构 CLP组小鼠肺细胞肿胀、广泛性空泡变性、核浓缩，胞浆疏松呈丝网状、着色深浅不一，纤维组织弥漫性增生，少量肺细胞萎缩、坏死。SHAM 组小鼠肺部结构清晰，无变性、坏死，肝细胞形态结构无异常，结构明晰，无炎性细胞浸润。见图1。

图1 两组小鼠病理切片（HE 染色，10×）

2.3 两组小鼠肺组织病理学评分结果比较

在实验过程中，对两组48 只小鼠进行组织病理学评分。经正态性检验发现数据不符合正态性，采用Mann-WhitneyU检验比较两组之间的差异性，经检验发现，不同时间点CLP 组小鼠的肺组织病理学评分明显高于SHAM 组，评分在实验后12 h 开始明显升高，在实验后24 h 到达最高值，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表1。

表1 两组小鼠肺组织病理学评分比较[分，M（P25，P75）]

2.4 血清指标的ELISA检测分析

在实验过程中，经正态性检验发现数据不符合正态性，采用Mann-WhitneyU检验比较两组之间的差异性，同时采用Friedman 秩和检验比较同一组不同时间浓度是否存在差异。经检验发现，CLP 组小鼠的S100A12 ELISA 检测水平明显高于SHAM 组，在实验后4 h 开始明显升高，在实验后12 h 到达最高值，之后稍有回落，差异有统计学意义（P< 0.05）。见表2。

表2 两组小鼠血清指标的S100A12 ELISA检测结果比较[ng/ml，M（P25，P75）]

2.5 组织各指标 RT-PCR 检测分析

经正态性检验发现数据均不符合正态性，采用Mann-WhitneyU检验比较两组之间的差异性，同时采用Friedman 秩和检验比较同一组不同时间浓度是否存在差异。经检验发现，CLP 组小鼠RAGE mRNA、NF-κB p65 mRNA、肿瘤坏死因子（tumor necrosis factor，TNF）-α mRNA 相对表达量相较于SHAM 组明显增高，其中RAGE mRNA 在实验后8 h 开始升高，至24 h到达最高值，差异有统计学意义（P< 0.05），见表3。NF-κB p65 mRNA、TNF-α mRNA 相对表达量在实验后4 h 即明显升高，并明显高于SHAM 组，差异有统计学意义（P< 0.05），见表4 ～5。

表3 两组小鼠RAGE RT-PCR检测结果比较（×10-3）[μg/μl，M（P25，P75）]

表4 两组小鼠NF-κB RT-PCR检测结果比较[μg/μl，M（P25，P75）]

表5 两组小鼠TNF-α RT-PCR检测结果比较[μg/μl，M（P25，P75）]

3 讨论

成人流行病学研究表明[4-5]，全球每年有超过1800 万例严重脓毒症，发病率为0.001%，且患者例数仍持续上涨，患者例数增长速度约为年均1.5%[6-8]。脓毒症属于急性感染疾病，患者一般机体水平相对较低，常有合并高血压、脑卒中等疾病的情况，目前临床上尚未有统一的有效治疗方案[9]。临床治疗脓毒症一般采用常规替代治疗、抗生素使用、单一细胞因子拮抗等治疗方案[10]。临床治疗和相关研究显示，这些治疗方案均不能获得较为理想的治疗效果，对患者预后水平的改善不利。进一步解析脓毒症的发病机制，通过明确脓毒症的具体病理机制来寻求新的治疗方案是当前脓毒症相关研究的重点之一。在过去的研究中[11-13]，脓毒症被认为是过度炎症反应，一般采取拮抗过度炎症的治疗方式进行治疗。但是随着研究的不断深入，脓毒症的病理机制进一步明确。脓毒症发病过程中，患者体内的各种细胞因子水平会持续升高，各种细胞因子互相作用，会导致患者血液中多种炎症因子水平过高，对患者造成一系列损伤级联反应[14]。脓毒症病情发作过程中的炎性因子反应是一个复杂的交互的网络作用，采用单一炎性因子拮抗治疗并不能取得较好的治疗效果。因此不少研究学者转向生物分子学[15]，试图从脓毒症的病理机制和炎症反应信号通路及相关蛋白入手，探究脓毒症的治疗方案。脓毒症发展过程中会引发全身炎症反应，患者机体中的多组织多器官都会受到一定程度的影响，患者很有可能会出现多种并发症。脓毒症继发急性肺损伤是脓毒症治疗过程中较为常见的一种并发症。当前针对脓毒症继发急性肺损伤还没有较好的治疗方案，原因在于脓毒症无法短期治愈，患者肺部会持续遭受损伤。本研究主要是针对脓毒症导致的急性肺损伤，结果显示随着脓毒症的加重，小鼠肺部组织受到损坏，肺部出现明显损伤，S100A12、RAGE、NF-κB、TNF-α 表达水平上升，S100A12 水平与促氧因子、肺部损伤存在正相关性，提示S100A12可能与脓毒症后急性肺损伤存在一定的关系。

结合已有的研究，可以合理推测在脓毒症小鼠急性肺损伤中S100A12 的表达与小鼠急性肺损伤病情发展存在一定的关系，S100A12 表达水平可能可以用于脓毒症患者诊断中，改善脓毒症患者急性肺损伤诊断水平不易、预后水平较低的问题。