基于网络药理学及分子对接探讨柴胡注射液退热的分子机制

张雨洁 胡珊珊 史元元 朱青梅 李东锋

新疆医科大学第一附属医院药学部，新疆 乌鲁木齐 830011

柴胡注射液（Chaihu Injection，CI）是北柴胡（Bupleurum chinense DC.）经水蒸气蒸馏法制成的注射剂，主成分为柴胡挥发油[1-2]。2020 版《中华人民共和国药典》收载的北柴胡为伞形科植物柴胡的干燥根。该药在1941 年研制，1954 年实现工业化生产[3]。2022 年8 月至2023 年1 月新疆医科大学第一附属医院急诊有273 例发热患者使用该药，单用者119 例，联合萘普生片者79 例，联合安痛定注射液者65例，联合萘普生片及安痛定注射液者10例。期间不良反应上报0 起，其退热效果好且较为安全。既往研究中柴胡主要含三萜皂苷类、挥发油、黄酮类等成分，具有解热、抗炎、抗病毒、保肝、抗肿瘤、降血脂、调节免疫等作用[2]。但对其退热机制的研究尚存在一定空缺，本研究旨在通过网络药理学及分子对接探究该机制。

1 资料与方法

1.1 CI活性成分筛选

在中药系统药理学数据库与分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）[4]中以口服生物利用度（oral bioavailability，OB）≥30%且类药性（drug-like，DL）≥0.18 检索柴胡活性成分，同时结合文献补充。从PubChem 数据库[5]中收集分子结构。

1.2 CI活性成分对应的靶点蛋白筛选

从UniProt 蛋白质数据库[6]中查询活性成分对应的靶点，并进行整理。

1.3 发热相关靶点筛选

以“ fever”为关键词在GeneCards 数据库[7]、DurgBank 数据库[8]、人类在线孟德尔遗传数据库（online Mendelian inheritance in man，OMIM）[9]中检索、去重。

1.4 CI退热靶点筛选及蛋白质-蛋白质相互作用（protein-protein interaction network，PPI）网络的建立

使用Venny 2.1 平台对1.2 和1.3 的结果取交集。使用STRING 数据库[10]对交集靶点进行互作分析。

1.5 构建“ CI-活性成分-靶点基因-发热”网络

把1.4 的结果导入Cytoscape 软件[11]，并进行分析获得“ CI-活性成分-靶点基因-发热”网络关系。

1.6 基因本体论（gene ontology，GO）及京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

通过DAVID 数据库[12]获取GO、KEGG 信号通路信息（P≤0.01），取前20 位结果进行分析解读。

1.7 分子对接

从PDB 数据库下载核心靶点结构信息，使用PyMOL 软件对结构进行预处理。利用AutoDock 软件处理靶蛋白，AutoDock Vina 模拟分子对接。

2 结果

2.1 药物成分靶点

将数据库中的活性成分与文献报道[2，13]的柠檬烯（limonene）、α-姜黄烯（α-curcumene）等12 个成分进行整合，见表1。有17 个柴胡活性成分对应210 个靶点。

表1 柴胡注射液活性成分

2.2 Venn图

将210 个药物靶点与1208 个疾病靶点取交集，获得102 个CI 退热的关键靶点，使用Venny 2.1 作图，见图1。

图1 CI 和发热交集靶点Venn 图

2.3 PPI网络

PPI 网络中有101 个点存在相互关系，点之间有1634 条连线，平均节点度值为32.4，平均局部聚类系数值为0.676，表明这些蛋白质之间有较多相互作用且在生物学上是部分相连的。见图2。

图2 柴胡注射液退热靶点PPI 网络

2.4 PPI网络拓扑分析

以邻近中心度数值>中位数0.5824、中介中心性数值>中位数0.0037、度值>中位数37 进行数据整理，获得核心靶点17 个，包括IL-6、TNF、AKT1 等，见表2。

表2 CI退热核心靶点

2.5 “ CI-活性成分-靶点基因-发热”网络关系

用Cytoscape 3.9.1 软件建立关联网络，点与点之间的关联以线条进行连接，连线越多表明存在的相互作用关系密切，核心作用的可能性越大，见图3。

图3 “ CI-活性成分-靶点基因-发热”关系网络

2.6 GO功能富集

GO 分析获得生物过程（biological process，BP）条目584 个，涉及对外来刺激的反应、细胞对肿瘤坏死因子的反应、炎症反应、对脂多糖的反应、血管生成、缺氧反应等过程；得到细胞成分（cellular component，CC）条目60 种，涉及细胞外隙、细胞表面、小窝等；获得分子功能（molecular function，MF）条目103 项，涉及酶结合、蛋白质结合等。选取P值排序选前10 位条目作图，见图4。

图4 GO 功能富集分析

2.7 KEGG通路富集

通过分析获得156 条通路信息（P< 0.01），涉及AGE-RAGE、TNF、IL-17、人巨细胞病毒感染、Toll样受体等信号通路。取前20 位作气泡图，见图5。

图5 KEGG 通路富集分析

2.8 分子对接验证

以活性成分的度值排名靠前、相互连接关系多为条件，选出8 个活性化合物以及10 个核心靶点进行分子对接，见表3。取结合能低、结合能力强的4 组信息，即槲皮素-PTGS2、山奈酚-PTGS2、异鼠李素-PTGS2、槲皮素-TP53，进行可视化作图，见图6。

图6 CI 成分与靶蛋白结合模式图

表3 CI成分与核心靶蛋白的结合能（kJ/mol）

3 讨论

CI 是普通感冒、流感及疟疾等所致发热的常用制剂之一。发热多为病原体引起机体应激反应，白细胞释放内源性致热源穿过血- 脑屏障，影响体温调节中枢的体温控制导致发热[14]。该药临床应用多、退热效果显著。分子对接中山奈酚、异鼠李素、槲皮素与核心靶点的结合能最低、结合构象更稳定。既往研究中槲皮素的抗炎作用与抑制细胞因子产生、降低环氧合酶和脂氧合酶表达相关[15]。山奈酚可调节促炎酶活性和炎症基因表达[16]，通过抑制转录因子、黏附分子以及基质金属蛋白酶等途径发挥抗炎作用[17]。异鼠李素可通过抑制炎症因子TNF-α、IL-1β、IL-6 的产生，发挥出强效的抗炎活性[18]。这3 种成分是CI 退热的中心活性成分。

KEGG 结果提示CI 退热作用与AGE-RAGE、TNF、IL-17、人巨细胞病毒感染等通路相关。它们均可触发NF-κB、MAPK 途径，另外还涉及PI3KAKT-mTOR、C/EBPs 途径等。通路激活后引起多种促炎细胞因子的表达，如IL-1、IL-6、GM-CSF、IL-8。其中，IL-1 与lL-1RI 结合可触发Toll 样受体信号通路。该通路能识别脂多糖、肽聚糖、脂蛋白及病毒后活化成熟树突细胞，提供获得性免疫的共刺激信号，促进lL-1β、IL-1α、IL-6、TNF-α 等细胞因子表达[19]。

PTGS2、TP53 是分子对接中最有可能发挥作用的靶点，PTGS2 的生物学功能是通过生成PGE2 和PGD2 进而控制身体温度、保护心血管健康、调节情绪等。TP53 编码抑癌蛋白能对多种细胞产生应激反应，调节靶基因表达从而诱导细胞周期阻滞、凋亡、DNA 修复等。

此外本研究结果提示CI 可能通过脂质和动脉粥样硬化、AGE-RAGE、癌症途径等相关通路发挥作用。综上所述，本研究探讨了CI 退热中心成分、核心靶点和通路之间的网络关系。但本研究局限在于分子对接验证是模拟状态，初步阐述了机制，今后将进一步探索CI 的作用机制。