利用网络药理学和分子对接技术分析“猫爪草-冬凌草”对肝癌的治疗作用机制

杨青斌 徐 静 李 进 司维群 刘 静 吴佳龙

1.贵州中医药大学，贵州 贵阳 550000；2.贵州中医药大学第二附属医院肿瘤科，贵州 贵阳 550000

肝癌指的是发生在肝脏的恶性肿瘤，主要包括转移性肝细胞癌和原发性肝细胞癌（hepatocellular carcinoma，HCC）。本文中的肝癌特指HCC。HCC 在我国恶性肿瘤疾病的排名靠前，其发病率位列第四位，致死率为第二位，严重威胁人类的生命健康[1]。HCC 治疗面临难度系数大、恶性高、中晚期疗效差、病情进展快等困难[2]。从中医学上讲，机体正气亏虚，肝失条达导致血痰凝滞，毒结不易化解遂发此症[3]。中药治疗除了稳定病情外，在抗转移方面优势也较为明显[4]。猫爪草属毛茛科，性甘辛、温平，具有解毒、化痰散结功效，对治疗直肠癌、肝癌等肿瘤能够起到积极效果[5]。冬凌草属唇形科，性微寒，对治疗肝癌、肺癌等有重要作用[6]。近年来，围绕猫爪草与冬凌草的分析和研究增多，如成分分析、药理分析等[7]。而在猫爪草与冬凌草抗癌作用机制及具体药效物质基础方面的研究却很有限[8]。因此，运用网络药理学和分子对接技术对猫爪草与冬凌草的抗癌机制分析，可以为这两种中药的临床应用研究提供一定的科学依据。

1 资料与方法

1.1 获取中药活性成分及作用靶点

在中药系统药理学数据库和分析平台（traditional Chinese medicine systems pharmacology database and analysis platform，TCMSP）与传统中药百科全书（the encyclopedia of traditional Chinese medicine，ETCM）数据库中采集活性成分；在有机小分子生物活性数据库（PubChem）中获得化学结构式；在小分子药物预测作用靶点平台（Swiss Targe Prediction）中获得作用靶点。

1.2 网络构建“药物-成分-作用靶点”

运用软件Cytoscope 3.9.1 制作“药物-成分-作用靶点”互作网络图，度值（Degree）的大小决定节点大小。

1.3 取药物与疾病靶点交集

在Gene Card 数据库中以“ hepatocellular carcinoma”为关键词进行检索相关疾病靶点，排除低关联度靶点后获得药物靶点，在疾病靶点和药物靶点中取交集靶点作为HCC 的潜在靶点。

1.4 蛋白互作（protein-protein interaction，PPI）网络

将筛选后的潜在靶点导入到STRING 平台，获取PPI 网络后做可视化处理。在PPI 网络图的构建中，度值决定节点大小，结合分数决定边的粗细。

1.5 构建“药物-成分-疾病靶点”网络

运用Cytoscope 3.9.1 软件制作“药物-成分-疾病靶点”互作网络图，借助“网络分析”功能获得互作度值，明确药物治疗HCC 的重要成分及相互作用力度。

1.6 京都基因与基因组百科全书（Kyoto encyclopedia of genes and genomes，KEGG）通路富集分析

在数据库Metascape 中，对获取的基因进行KEGG 通路富集分析。

1.7 分子对接研究方法

从蛋白质结构数据库（protein data bank，PDB）中下载蛋白靶标的晶体结构文件，通过软件ChemDraw 绘制其化学成分结构，并在软件Autodock 4.2.6 中将化合物与蛋白靶标虚拟对接。通过软件PyMOL 2.2.0、DS2019 对对接模式图进行可视化分析。

2 结果

2.1 活性成分的筛选

在数据库TCMSP 中以生物利用度（oral bioavailability，OB）值≥30、类药性（drug-likes，DL）值≥0.18 筛选出猫爪草活性化合物9 个，冬凌草23个。按猫爪草、冬凌草首拼音缩写MZC1 ～MZC12、DLC1 ～DLC24 进行编号，活性化合物及参数信息见表1 ～2。

表1 猫爪草活性化合物及其参数信息

表2 冬凌草活性化合物及其参数信息

2.2 猫爪草与冬凌草活性成分-靶点网络的构建

通过TCMSP 数据库分析，总结出猫爪草、冬凌草药物靶点蛋白分别有560、1257 个。靶点蛋白所对应的基因名称通过蛋白质信息数据库UniPort 获得，剔除未获取到基因名称、非人源基因及重复出现的基因后得到猫爪草、冬凌草靶点蛋白分别有459、561 个，其中共同靶点蛋白有299 个，见图1。

图1 猫爪草与冬凌草的活性成分-靶点图

2.3 构建猫爪草与冬凌草药物靶点-肝癌靶点网络

从数据库Gene Card 与Drugbank 中分别获得HCC 相关靶点4307 个和763 个，去除共有的42 个重复基因和靶点后，剩余4265 个和721 个，见图2。

2.4 猫爪草与冬凌草活性成分靶点和肝癌靶点网络数据图

运用UnitProt 数据库对靶点数据进行标准化，发现两味药与HCC 共有靶点26 个，其中猫爪草12 个、冬凌草14 个。运用软件Cytoscope 3.9.1 建立所得的药物活性成分及HCC 两类靶点网络数据图，涉及节点721 个、边数2483 条，见图3。图中节点的度值表现为与其他节点的连通性，与关键性成正比。

图3 猫爪草与冬凌草活性成分靶点和癌症靶点网络图

2.5 构建猫爪草与冬凌草作用肝癌靶点PPI网络

将STRING 数据库中获取的制表符分隔值数据导入软件CytoScope 3.9.1 中，构建PPI 网络后进行拓扑分析。结果表明与其他靶点比较，病毒癌基因（sarcoma gene，SRC）、丝裂原活化蛋白激酶（mitogenactivated protein kinase，MAPK）、信号传导及转录激活蛋白（signal transducer and activator of transcription，STAT3）等基因的节点度值明显更高，见图4。

图4 猫爪草与冬凌草作用肝癌靶点PPI 网络

2.6 PPI靶点基因的KEGG通路

采取KEGG 通路对从Metascape 数据库所得的共同靶点进行探究，获得20 条信号通路网络图（图5），“成分-靶点-通路”网络图（图6）。从图中可见通路和靶点之间有着密切联系，其中以“癌症的通路（pathways in cancer）”与“过氧化物酶体增殖物激活受体（peroxisome proliferator activated receptor，PPARA）”靶点的关系最为密切。

图5 KEGG 通路富集化分析气泡图

图6 “成分-靶点-通路”网络图

2.7 分子对接

将维生素肌醇、太白冬凌草素和谷甾醇葡萄糖苷等活性因子与丝氨酸/苏氨酸蛋白激酶蛋白Akt1（serine/threonine kinase 1，Akt1）交集靶点逐一进行对接，若分子对接的结合能<0 kJ/mol 表明靶点蛋白与化合物自然状态下可自发结合。运用软件PyMOL 2.4.0 和AutoDock 进行可视化对接，将对接结果绘制为三维图，见图7A ～C。由此可知，猫爪草与冬凌草在抑制癌细胞生长和繁殖方面具有积极作用，维生素肌醇、太白冬凌草素和谷甾醇葡萄糖苷等活性因子是产生影响的主要要素。

图7 猫爪草与冬凌草活性成分与靶点蛋白对接三维图

3 讨论

利用TCMSP 数据库检索出32 个经确认的活性化合物，其中猫爪草9 个、冬凌草23 个。甾醇单葡萄糖苷和泰白鲁贝森素A 分别是猫爪草和冬凌草中能够进行相互作用最多的靶蛋白，意味着这两种成分极有可能是猫爪草与冬凌草中能够抑制癌细胞生长的主要成分。

PPI 网络显示，SRC、MAPK1、MAPK3 及STAT3 基因显著高于其他靶点。这几个靶点大概率就是猫爪草与冬凌草对HCC 细胞进行作用影响时所附着的主要靶点。细胞外的SRC 能够激活SRC 蛋白的细胞质复合物蛋白，促进细胞的增殖与生长以及肿瘤的转移、侵袭[9]。MAPK 信号通路对细胞的发育与分化以及生物的合成具有重要作用，将其应用于肿瘤治疗中，能够阻碍肿瘤细 胞的发展，加速肿瘤细胞的凋亡[10]。激活STAT3 通路，会促进肿瘤细胞的转移、侵袭与生长，影响预后疗效。而借助介导STAT3 通路则可以对癌细胞的凋亡与增殖产生影响[11]。

为了获悉猫爪草与冬凌草治疗HCC 的作用机制，本研究对所涉及到的交集靶点展开了KEGG 分析。结果显示，细胞组分在大多数情况下都密集分布在膜筏、细胞体、膜微区等系列要素中，进而调控癌症通路（pathways in cancer）、脂质和动脉粥样硬化（lipid and atherosclerosis）和PI3K-Akt 信号通路（PI3K-Akt signaling pathwary）等，从而发挥出冬凌草和猫爪草对HCC细胞的抑制效用。癌症通路可经生长因子、炎症、细胞因子等细胞外刺激激活，不同亚家族激活后经磷酸化转录因子、细胞骨架相关蛋白和酶等多种底物相互调节来介导、传递有丝分裂原信号调节细胞的存活、增殖和分化，从而在癌症的发生发展中起重要作用[12]。血浆脂蛋白含有不同量的脂质氧化产物，已知脂质氧化产物会损害正常生理功能并刺激动脉粥样硬化过程。血浆脂蛋白是脂质氧化产物的活性载体，大量数据表明，脂蛋白脂质氧化产物转运与动脉粥样硬化的风险有关[13-14]。PI3K 这种细胞内的信号蛋白，具有催化活性的作用，能够对下游的Akt 磷酸化水平进行有效调控，在两者的协同作用下构建起了PI3K-Akt 信号通路，并对系列细胞迁移产生一定影响[15]。PI3K-Akt 信号通路会多方面地影响肿瘤细胞，使肿瘤细胞的发育受阻[16]，SRC、MAPK1、MAPK3 及STAT3 等关键靶点富集于此通路中。由此可见，猫爪草与冬凌草在HCC 治疗中PI3K-Akt 信号通路发挥重要作用，这可能是猫爪草与冬凌草对HCC 有较好疗效的分子机制。

本研究借助网络药理学与分子对接有关策略明确了猫爪草与冬凌草中潜在的有效成分如维生素肌醇、太白冬凌草素和谷甾醇葡萄糖苷等。这些成分作用于SRC、MAPK1、MAPK3 及STAT3 等多个靶点，并通过癌症通路、PI3K-Akt 信号通路等参与外在激酶活性的调节、对激素的反应、平滑肌细胞增殖的调节等，进而发挥对HCC 的治疗作用。由于中药的口服使用在不同人体内的实际药效并不相同，导致分析筛选出的活性成分和效果也不尽相同。因此，在今后的研究分析中还需进行深度的探讨，以保证该结论的正确性和科学性。