骨形态发生蛋白5对肝癌细胞生物学行为的影响及机制

马东玥，臧艳，任俏慧，朱欣悦，王莲子，吕伟，姚骏骁，周心怡，余莉，李涛

1 安徽医科大学第一附属医院检验科，合肥 230022；2 病原生物学安徽省重点实验室

根据2020 年的全球癌症统计，肝癌是第六大常见的恶性肿瘤，居癌症死亡第三位［1］。肝癌病理生理机制复杂，多种因素参与肝细胞的恶性转化以及肿瘤进展，包括遗传易感性、病毒因素、细胞微环境等［2］。探索肿瘤微环境中多种细胞因子对肿瘤发生发展的作用，可能对肝癌治疗具有潜在意义［3］。骨形态发生蛋白（BMP）是属于TGF-β家族的分泌型蛋白［4］，可参与调节细胞增殖、分化等多种细胞生物学行为［5-6］。已有研究表明，BMP5 可能参与肿瘤的发生发展。有关胰腺癌的研究发现BMP5 在癌组织中低表达，使用外源性BMP5 处理胰腺癌细胞能抑制细胞增殖，促进其迁移和侵袭［7］。而在皮肤组织的研究显示，BMP5 可诱导骨髓来源细胞的角蛋白表达，从而促进慢性皮肤肿瘤的进展［8］。然而BMP5在肝癌中的表达及对肝癌的作用鲜见报道。2023 年1月—12月，本研究检测BMP5在肝癌细胞中的表达，探究其在肝癌细胞系中对细胞增殖、凋亡、迁移能力的影响及机制。

1 材料与方法

1.1 材料 人正常肝细胞系L02 来自本实验室保存，肝癌细胞系Hep3B、Huh7 购自广州赛库生物技术有限公司。RPMI 1640 培养基、DMEM 培养基购自武汉普诺赛生命科技有限公司；胎牛血清（FBS）购自南京维森特生物技术有限公司；总RNA 提取试剂TRIzol、Annexin-V/PI 凋亡检测试剂盒购自美国ThermoFisher Scientific 公司；Hifair®Ⅲ 1st Strand cDNA Synthesis SuperMix、Hieff®qPCR SYBR Green Master Mix 购自上海翌圣生物科技股份有限公司；BMP5、GAPDH 引物购自上海生工生物工程有限公司；PVDF 膜购自美国Millipore 公司；GAPDH、PCNA抗体购自美国Affinity 公司；羊抗兔/羊抗鼠二抗购自美国Proteintech 公司；BMP5 抗体购自美国SANTA CRUZ 及Affinity 公司；SMAD3、磷酸化SMAD3（p-SMAD3）抗体购自美国Abcam 公司；重组人骨形态发生蛋白5（rh-BMP5）购自美国R＆D 公司；CCK-8试剂盒购自广州Biosharp 公司。实时荧光定量PCR仪（美国Roche公司）；电泳仪、转膜仪及化学发光凝胶成像仪（美国BIO-RAD公司）；Infinite F50型自动酶标分析仪（瑞士TECAN公司）；流式细胞仪购自美国BD公司；正置及倒置光学显微镜（德国Zeiss公司）。

1.2 细胞中BMP5 mRNA 表达检测 采用实时荧光定量PCR 法。TRIzol 法提取细胞总RNA，反转录为cDNA。实时荧光定量PCR 仪上以cDNA 为模板完成实时荧光定量PCR（qRT-PCR）反应扩增检测。BMP5 正向引物：5'-TGGCAGGACTGGATTATAGCA-3'，反向引物：5'-CAAGGCTTTGGTACGTGGTC-3'；GAPDH 作为内参基因，正向引物：5'-GAGTCAACGGATTTGGTCGT-3'，反向引物5'-GACAAGCTTCCCGTTCTCAG-3'。检测各模板Ct 值，以2-ΔΔCt法分析各细胞系中BMP5基因相对于内参基因的表达。

1.3 细胞培养及分组 细胞置于37 ℃ 5%CO2细胞培养箱中，分别以含10%FBS 的RPMI1640培养基培养L02 细胞、DMEM 培养基培养Hep3B、Huh7 细胞。rh-BMP5 处理人肝癌细胞系Hep3B、Huh7，分为NC组及rh-BMP5 低剂量组、rh-BMP5 中剂量组、rh-BMP5高剂量组。NC组予以不含rh-BMP5的无血清培养基培养，rh-BMP5 低、中、高剂量组予以无血清培养基配制的1、10、100 ng/mL rh-BMP5 用于后续实验。

1.4 细胞增殖能力检测 采用CCK-8法。将NC组及rh-BMP5 低、中、高剂量组的Hep3B、Huh7 细胞培养于6孔板中，收集各组对数生长期细胞，分别用无血清培养基及含1、10、100 ng/mL rh-BMP5的无血清培养基重选为细胞悬液，每组设置3个复孔，每孔加入100 μL 细胞悬液，同时设仅加无血清培养基的空白对照。分别培养24、48 h 后每孔加入CCK-8 试剂10 μL于培养箱中继续孵育2 h。酶标仪450 nm波长测定各孔光密度（OD）值，以各组OD 值计算细胞活力，代表细胞增殖能力。细胞活力=（As-Ab）/（Ac-Ab）×100%，As 为加rh-BMP5 的处理孔，Ab 为空白孔，As为对照孔。

1.5 细胞凋亡检测 采用流式细胞术。将NC 组及rh-BMP5 低、中、高剂量组的Hep3B、Huh7 细胞培养于6 孔板中，收集各组细胞于BD 适配流式管中，1 000 r/min离心5 min半径，弃上清，4 ℃预冷PBS轻柔洗涤细胞沉淀，重复1 次。然后配置1×Binding Buffer 洗涤细胞沉淀1 次，1 000 r/min 离心5 min（半径7.6 cm），收集细胞沉淀，195 μL 1× Binding Buffer轻柔重悬细胞，加入5 μL Annexin-V-FITC 混匀染色，4 ℃避光10 min，200 μL 1× Binding Buffer洗涤细胞，1 000 r/min 离心5 min（半径7.6 cm），收集细胞沉淀，190 μL 1× Binding Buffer 重选细胞，加入5 μL Propidium Iodide（PI）染色，4 ℃避光5 min，轻柔混匀后上机检测。

1.6 细胞迁移率测算 采用细胞划痕实验。收集对数生长期的Hep3B、Huh7细胞培养于6孔板中，根据细胞的大小控制铺板密度。置于细胞培养箱中过夜培养后于孔板底部作划痕。加入无血清培养基及含1、10、100 ng/mL rh-BMP5 的无血清培养基，再置于细胞培养箱中培养24 h及48 h，200倍倒置显微镜下拍照，用ImageJ分析迁移面积并计算迁移率。

1.7 SMAD信号分子和PCNA蛋白表达检测 采用Western blotting 法。将NC 组及rh-BMP5 低、中、高剂量组的Hep3B、Huh7细胞培养于6孔板中，收集各组对数生长期细胞，加入适量含PMSF 的RIPA 蛋白裂解液，充分吹打混匀，冰上静置30 min，4 ℃下12 000 r/min离心10 min（半径8.5 cm），收集上清液测定蛋白浓度。然后经SDS-PAGE 凝胶电泳、转膜、封闭，一抗（SMAD3 1∶1 000、p-SMAD3 1∶1 000、PCNA 1∶2 000、GAPDH 1∶2 000），4 ℃摇床孵育过夜，TBST 洗膜后二抗（1∶10 000）室温孵育1 h，ECL发光液显影并存档。ImageJ软件对目标条带进行灰度识别，以目的蛋白与内参蛋白GAPDH 的灰度比值作为目的蛋白的相对表达量。

1.8 统计学方法 采用GraphPad Prism9.0 统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，两组间比较采用配对t检验，多组间比较采用单因素方差分析或Kruskal-Wallis 检验。P＜0.05 为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 BMP5 mRNA 在肝癌细胞系中的表达 正常肝细胞系L02、肝癌细胞系Hep3B 和Huh7 中BMP5 mRNA 相对表达量分别为1.000、4.929 ± 0.486、27.75 ± 1.975，与正常肝细胞系L02 相比，BMP5 mRNA 在肝癌细胞系Hep3B 和Huh7 中相对表达量升高（P均＜0.05）。

2.2 BMP5 对肝癌细胞增殖能力的影响 与NC 组相比，低剂量组在培养24、48 h时细胞增殖能力增加，但未见统计学差异；而中、高剂量组在24、48 h较NC组细胞增殖能力均显著增加（P均＜0.05），见表1。

表1 各组不同时点细胞活力（%， ± s）

表1 各组不同时点细胞活力（%， ± s）

组别NC组低剂量组中剂量组高剂量组96.01 ± 6.49 153.40 ± 8.97 185.70 ± 21.59 224.20 ± 15.00 Hep3B细胞活力24 h48 h 113.6 ± 9.98 176.4 ± 14.89 241.8 ± 12.08 266.0 ± 22.19 Huh7细胞活力24 h 98.41 ± 0.74 104.00 ± 0.77 113.6 ± 2.59 118.7 ± 2.23 48 h 100.9 ± 2.65 125.6 ± 1.29 128.1 ± 3.52 129.3 ± 4.82

2.3 BMP5对肝癌细胞凋亡的影响 在Hep3B细胞中，与NC 组相比，培养24 h 后，低、中、高剂量组细胞凋亡率下降（P均＜0.05）；培养48 h后，低、中剂量组与NC 组相比凋亡率下降，但差异无统计学意义，而高剂量组凋亡率低于NC 组（P＜0.05）。在Huh7细胞中，rh-BMP5 低剂量组凋亡率在24、48 h 较对照组均无统计学差异，而中、高剂量组与NC 组相比凋亡率显著下降（P均＜0.05），见表2。

表2 各组不同时点细胞凋亡率（%， ± s）

表2 各组不同时点细胞凋亡率（%， ± s）

组别NC组低剂量组中剂量组高剂量组10.03 ± 0.93 4.90 ± 1.12 3.23 ± 0.39 2.48 ± 0.21 Hep3B细胞凋亡率24 h48 h 10.82 ± 0.65 10.68 ± 0.61 7.98 ± 0.57 6.19 ± 0.68 Huh7细胞凋亡率24 h 9.10 ± 0.59 6.04 ± 0.94 3.37 ± 0.16 3.26 ± 0.17 48 h 11.04 ± 0.87 6.58 ± 1.24 5.49 ± 1.00 4.36 ± 0.75

2.4 BMP5 对肝癌细胞迁移能力的影响 在处理24 及48 h 后，与NC 组相比，rh-BMP5 低、中剂量组的Hep3B、Huh7 细胞迁移率增加，但无统计学差异；而高剂量组在24 h 及48 h 与NC组相比迁移率均显著增加（P均＜0.05），见表3。

表3 各组不同时点细胞迁移率（%， ± s）

表3 各组不同时点细胞迁移率（%， ± s）

组别NC组低剂量组中剂量组高剂量组Hep3B细胞迁移率24 h48 h24 h48 h 43 ± 4.0059.91 ± 1.0412.37 ± 3.5324.50 ± 5.21 50 ± 6.4863.57 ± 1.1615.43 ± 5.5027.48 ± 8.68 61 ± 5.5270.77 ± 1.3623.02 ± 5.1839.86 ± 6.16 68 ± 7.2774.92 ± 5.0734.81 ± 8.4351.60 ± 2.23 27.37.43.54.Huh7细胞迁移率

2.5 不同浓度BMP5对肝癌细胞SMAD通路蛋白表达的影响 选取0、1、10、100 ng/mL浓度的rh-BMP5处理肝癌细胞系Hep3B 及Huh7，Western blotting 结果显示，与0 ng/mL浓度相比，rh-BMP5 100 ng/mL浓度处理细胞后PCNA蛋白表达上调，p-SMAD3蛋白表达升高，差异有统计学意义（P均＜0.05），见表4。

表4 不同浓度BMP5对肝癌细胞SMAD通路蛋白表达的影响（ ± s）

表4 不同浓度BMP5对肝癌细胞SMAD通路蛋白表达的影响（ ± s）

细胞系蛋白相对表达量/GAPDH NC组低剂量组中剂量组高剂量组Hep3B p-SMAD3 PCNA Huh7 0.054 ± 0.003 0.826 ± 0.113 0.067 ± 0.004 1.074 ± 0.077 0.114 ± 0.004 1.144 ± 0.050 0.475 ± 0.029 1.380 ± 0.059 p-SMAD3 PCNA 0.124 ± 0.007 0.695 ± 0.022 0.126 ± 0.004 0.882 ± 0.048 0.127 ± 0.002 0.920 ± 0.048 0.318 ± 0.007 1.282 ± 0.034

3 讨论

肝癌是严重威胁人类健康的癌症之一，预计到2025 年肝癌发病人数将超过 100 万例［2］。2020年，肝癌在46个国家位列癌症死亡原因的前三名，并且是癌症导致过早死亡的第二大常见原因［9］。尽管目前肝癌在外科治疗、化疗、免疫治疗等方面均取得一定进展［10-12］，但肝癌的临床治疗效果仍不能达到预期水平。因此，探索肝癌的发生发展机制，寻找新的有效治疗靶点，成为肝癌不断研究的重点。

骨形态发生蛋白是一种多功能的生长因子蛋白，属于TGF-β 家族［13］，最初发现在骨形成中起作用，因其在多器官中的功能受到关注。BMP 通过跨膜受体由胞质内SMAD 介导参与多种细胞过程的调节［14-15］。当前研究表明BMP5 可能参与多种癌症的发生［16］。除前述提及的胰腺癌、皮肤病变之外，在肾上腺皮质腺癌中，使用BMP5 重组蛋白处理肿瘤细胞可通过激活SMAD 信号通路抑制癌细胞增殖［17］。但目前BMP5 在肝癌细胞的表达及作用仍不明确，因此本研究首先在正常肝细胞系及肝癌细胞系中进行检测，BMP5 mRNA 在Hep3B 及Huh7 肝癌细胞系中表达高于正常肝细胞系L02，提示BMP5可能参与肝癌的发生。

鉴于BMP5 是一种分泌型蛋白，BMP5 在胞外可通过与膜受体结合进行跨膜信号转导，因此我们采用rh-BMP5 进一步研究BMP5 对肝癌细胞生物学特征的影响。我们选取两种常用的人肝癌细胞系Hep3B 和Huh7 进行体外实验，观察不同浓度rh-BMP5 对肝癌细胞增殖、凋亡及迁移等生物学特性的影响。结果显示中剂量组（10 ng/mL）及高剂量组（100 ng/mL）的rh-BMP5 对Hep3B 和Huh7 增殖均有促进作用，而在低剂量组（1 ng/mL）中，细胞活力在培养24 h 和48 h 与NC 组相比无统计学差异，提示BMP5 对肿瘤细胞增殖的作用可能与其浓度有关。与细胞增殖类似，在凋亡方面，高剂量rh-BMP5能显著抑制肝癌细胞凋亡，而低剂量组与NC 组相比无统计学差异。划痕实验显示，高剂量rh-BMP5对肝癌细胞迁移能力具有促进作用，并且与处理时间有关，在24 h时即可促进细胞迁移，且在48 h时更为明显。本研究结果显示BMP5 能够促进肝癌细胞增殖及迁移，并抑制细胞凋亡，提示BMP5 可能对肝癌细胞恶性生物学行为有促进作用。

我们进一步研究BMP5 对下游信号通路的影响。在依赖SMAD 的经典BMP 信号通路中，BMP 配体与靶细胞表面的BMPⅠ型和Ⅱ型丝/苏氨酸激酶受体结合发挥其细胞效应［14，18］。BMPⅡ型受体具有激酶活性，在BMP 信号诱导的受体复合物形成后可以磷酸化Ⅰ型受体，而Ⅰ型受体的激活会进一步磷酸化胞内的受体调控SMAD（R-SMAD），并募集SMAD4，易位进入细胞核［18-20］，与 DNA 结合，作为转录因子参与下游靶基因转录调节［21］。JIN 等［22］研究发现，BMP5 处理乳腺癌细胞系可增加磷酸化SMAD1/5/9 的表达。外源性BMP2 可诱导膀胱癌、乳腺癌、结肠癌、卵巢癌、胰腺癌和前列腺癌的小鼠和人类癌细胞系模型SMAD2 和/或SMAD3 磷酸化，入核并诱导下游靶基因表达［23］。说明不同BMPs 可能通过不同下游SMADs 分子发挥生物学效应。Western blotting 结果显示，高剂量组rh-BMP5 处理肝癌细胞后p-SMAD3 升高，说明BMP5 可能通过SMAD3 活化行使其生物学效应。此外，对增殖相关蛋白PCNA 的检测显示，BMP5 处理可增加PCNA 的表达，这与前述BMP5 促进肝癌细胞增殖的结果一致。

值得注意的是，虽然BMP5 对Hep3B 和Huh7 细胞生物学特性的促进作用趋势总体一致，但Hep3B和Huh7 对BMP5 的反应性存在差异。在细胞增殖方面，高剂量BMP5 对Hep3B 细胞活力的促进作用相较于Huh7 更加明显，可增加Hep3B 细胞活力1 倍以上；而在SMAD3磷酸化方面，BMP5诱导Hep3B中SMAD3 的活化也较Huh7 更为显著。我们推测这可能是由于Hep3B 和Huh7 细胞系在来源上具有异质性，与Hep3B 相比，Huh7 存在更高的基线BMP5 表达，因此对外源性BMP5的反应性低于Hep3B细胞。综上所述，BMP5 在肝癌细胞系中表达升高，具有促进肝癌细胞增殖及迁移、抑制细胞凋亡的作用，并能增加SMAD3 磷酸化，提示BMP5 在肝癌中具有潜在的促癌作用，但其临床价值及深入分子机制仍需进一步研究阐明。