lncR-HOXA-AS3 靶向miR-29a 对前列腺癌细胞凋亡和自噬的影响

李强，刘晶，张国民，王亮，刘志飞，朱研峰

1 开滦总医院林西医院泌尿外科，河北唐山 063100；2 唐山市人民医院泌尿外科

前列腺癌（PCa）是男性尤其是发达国家男性癌症死亡的主要原因，近年来发病率呈上升趋势［1］。尽管在过去的几十年里，药物治疗、放射治疗、前列腺根治术和扩大盆腔淋巴结清扫取得巨大成就，但约20%的患者诊断时已为晚期或远处转移，这部分PCa患者预后不良的问题目前仍未解决［2-3］。自噬是细胞程序性死亡的途径之一，自噬在肿瘤的发生发展中发挥多种作用，一方面，适当的自噬可降低细胞内有害物质，维持肿瘤细胞的生存；另一方面，过度自噬可诱导肿瘤细胞凋亡［4］。研究表明，长链非编码RNA（lncR）作为致癌基因或抑癌基因，能调控肿瘤细胞增殖、凋亡及自噬，在多种癌症的发生、发展和转移中起重要作用［5］。lncR-HOXA-AS3 是一种位于染色体7p15.2 的新型lncR，是一组高度同源的转录因子，主要调节胚胎发育。既往研究报道，在多种肿瘤组织和细胞中观察到lncR-HOXA-AS3 表达上调，并能促进肿瘤进展和预测患者不良预后［6-8］。但至今，PCa 中lncR-HOXA-AS3 表达及作用机制的研究甚少。近期文献证实，lncR-HOXA-AS3 可通过靶向调控miR-29a 影响肿瘤细胞的生物学行为［9］。2022 年5 月—12 月，本研究探讨lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 在PCa 细胞系中的表达变化，并观察其对PCa细胞凋亡及自噬的影响。

1 材料与方法

1.1 材料 人PCa 细胞系LNCaP、C4-2B、DU-145及正常前列腺细胞系RWPE-1均购自中国典型培养物保藏中心。TRIzol试剂购自北京天根生化科技有限公司；Annexin V-FITC细胞凋亡试剂盒购自南京凯基生物技术发展有限公司；LipofectamineTM3000购自美国Invitrogen公司；双荧光素酶报告基因试剂盒购自美国Promega 公司；RIPA 裂解液购自江苏碧云天生物技术有限公司；反转录试剂盒、RT-qPCR试剂盒均购自日本TaKaRa公司；lncRNA沉默质粒阴性对照si-NC、lncR-HOXA-AS3 沉默质粒si-HOXA-AS3、miRNA 抑制物阴性对照anti-miR-NC、miR-29a 抑制物anti-miR-29a、miRNA模拟物阴性对照mimics-NC、miR-29a模拟物miR-29 mimics、荧光素酶报告基因质粒野生型HOXA-AS3-WT、突变型HOXA-AS3-MUT均购自上海吉玛制药技术有限有限公司；抗Caspase-3、抗LC3，抗Beclin1、抗GAPDH 一抗及HRP标记的二抗IgG均购自美国Cell Signaling Technology公司。

1.2 细胞培养、转染及分组 将LNCaP、C4-2B、DU-145 细胞接种至含10%胎牛血清RPMI 1460 培养基，RWPE-1细胞接种至含10%胎牛血清D-KSFM培养基中，均放置于37 ℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养。转染操作时，取对数生长期LNCaP 细胞接种于6孔细胞板内，应用LipofectamineTM3000按照说明书操作，分别将si-HOXA-AS3、si-NC、si-HOXAAS3+anti-miR-NC、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 转染至LNCaP 细胞，转染后细胞分为si-HOXA-AS3 组、si-NC 组、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 组、si-HOXAAS3+anti-miR-29a 组，转染12 h 后，将培养基更换为含10%胎牛血清的RPMI 1460 培养基，继续置于37 ℃、5%CO2恒温细胞培养箱中培养中培养48 h。

1.3 lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 表达检测 采用RT-qPCR 法。应用TRIzol 法提取DU-145、LNCaP、C4-2B 和RWPE-1 细胞总RNA，紫外分光光度计检测RNA 样品OD260/OD280值1.8～2.0 为合格标准。按照Prime ScriptTMⅡ 1 Strand CDNA Synthesis Kit反转录试剂盒反转录获得cDNA，应用RT-qPCR 试剂盒按照说明书加入PCR 引物，进行PCR 扩增反应。lncR-HOXA-AS3 正向引物：5'-AGGAAACATCAGGGCGTACA-3'，反向引物：5'-ATCCTAAGTGCTTGCACCCT-3'；miR-29a 正向引物：5'-TAGCACCATCTGAAATCGGTTA-3'，反向引物：5'-GCGAGCACAGAATTAATACGAC-3'；内参GAPDH 正向引物：5'-CGGAGTCAACGGATTTGGTCGTAT-3'，反向引物：5'-AGCCTTCTCCATGGTGGTGAAGAC-3'。内参U6 正向引物：5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物：5'-AACGCTTCACGAATTTGCGT-3'。PCR反应条件：94 ℃ 15 min、94 ℃ 30 s、60 ℃ 30 s、72 ℃30 s，共40 个循环。lncR-HOXA-AS3 和miR-29a 的相对表达量应用2-ΔΔCt法计算。

1.4 细胞凋亡率检测 采用流式细胞术测算细胞凋亡率。收集各组LNCaP细胞，PBS液清洗2次，加入预冷结合缓冲液，制备细胞悬液（细胞密度1×106/mL）。取100 μL 细胞悬液置入流式管，避光条件加入5 μL PI 和5 μL Annexin V-FITC，避光继续孵育15 min，加入预冷的结合缓冲液混匀后，立即用流式细胞仪测算细胞凋亡率。

1.5 Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1 蛋白表达检测 采用Western blotting 法检测蛋白的相对表达量。取各组LNCaP 细胞，RIPA 裂解冰上裂解20 min，离心取上清液，BCA 法测定蛋白浓度。每泳道加入等量总蛋白进行上样，10 % SDS-PAGE 电泳分离蛋白，湿转法转移至PVDF 膜，5%脱脂牛奶里室温封闭2 h，TBST 洗膜3 次，加入一抗Caspase-3（1∶1 000）、LC3（1∶1 000）、Beclin1（1∶2 000）、GAPDH（1∶5 000）抗体后，室温孵育，次日洗膜后加入二抗，ECL显影，ImageJ软件分析条带灰度值。

1.6 双荧光素酶报告基因实验验证 取LNCaP 细胞接种于24 孔细胞板，按照LipofectamineTM3000 说明书操作，将HOXA-AS3-WT、HOXA-AS3-MUT，与miR-29 mimics或mimics-NC共转染至LNCaP细胞，转染后分别命名为HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 组、HOXA-AS3-WT+mimics-NC 组、HOXA-AS3-MUT+miR-29 mimics 组、HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 组。转染24 h后，细胞裂解液裂解细胞，应用双荧光素酶检测试剂盒检测各组细胞的相对荧光素酶活性。

1.7 统计学方法 采用SPSS21.0 统计软件。计量数据符合正态分布以±s表示，比较采用t检验，多组间比较采用单因素方差分析，进一步两两比较采用SNK法。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 PCa 中lncR-HOXA-AS3、miR-29a 表达比较RT-qPCR 结果显示，RWPE-1、DU-145、LNCaP、C4-2B 细胞中lncR-HOXA-AS3的相对表达量分别为1.00 ± 0.04、1.71 ± 0.07、1.92 ± 0.12、1.77 ±0.18；miR-29a 的相对表达量分别为1.05 ± 0.03、0.66 ± 0.08、0.47 ± 0.09、0.63 ± 0.10。与RWPE-1相比，DU-145、LNCaP、C4-2B 细胞系中lncR-HOXAAS3表达均升高（P均＜0.05），miR-29a表达均降低（P均＜0.05）。选取LNCaP细胞进行后续实验。

2.2 各组荧光素酶活性及LNCaP 细胞miR-29a 相对表达量比较 双荧光素酶报告基因实验结果显示，HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 组、HOXA-AS3-WT+mimics-NC 组、HOXA-AS3-MUT+miR-29 mimics组、HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 组LNCaP 细胞相对荧光素酶活性分别为0.48 ± 0.07、0.99 ± 0.04、1.02 ± 0.05、1.04 ± 0.06。HOXA-AS3-WT+miR-29 mimics 组LNCaP 细胞相对荧光素酶活性低于HOXA-AS3-WT+mimics-NC 组（P＜0.05），而HOXAAS3-MUT+miR-29 mimics 组与HOXA-AS3-MUT+mimics-NC 组LNCaP 细胞相对荧光素酶活性比较，差异无统计学意义（P>0.05）。

si-NC 组、si-HOXA-AS3 组、si-HOXA-AS3+antimiR-NC 组、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 组miR-29a相对表达量分别为1.05 ± 0.03、3.15 ± 0.32、3.21 ±0.28、1.32 ± 0.21。与si-NC 组相比，si-HOXA-AS3组、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 组LNCaP 细胞中miR-29a 表达升高（P均＜0.05）；与si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 组相比，si-HOXA-AS3 组、si-HOXAAS3+anti-miR-NC组miR-29a表达升高（P均＜0.05）。提示lncR-HOXA-AS3靶向调控miR-29a表达。

2.3 各组细胞凋亡率比较 si-NC组、si-HOXA-AS3组、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 组、si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 组细胞凋亡率分别为（5.3 ± 1.4）%、（20.6 ± 3.1）%、（21.3 ± 2.9）%、（7.5 ± 1.8）%。与si-NC 组相比，si-HOXA-AS3 组、si-HOXA-AS3+antimiR-NC 组细胞凋亡率升高（P均＜0.05）；与si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 组相比，si-HOXA-AS3组、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 组细胞凋亡率升高（P均＜0.05）。提示沉默lncR-HOXA-AS3 可促进LNCaP 细胞凋亡，转染anti-miR-29a 能逆转沉默lncR-HOXA-AS3对LNCaP细胞凋亡的促进作用。

2.4 各组Caspase-3、LC3II/LC3I 及Beclin 1 蛋白表达比较 见表1、图1。与si-NC组相比，si-HOXA-AS3组、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 组LNCaP 细胞Caspase-3、LC3II/LC3I 及Beclin 1 蛋白表达升高（P均＜0.05）。 与si-HOXA-AS3+anti-miR-29a 组相比，si-HOXA-AS3 组、si-HOXA-AS3+anti-miR-NC 组LNCaP 细胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin1 蛋白表达升高（P均＜0.05）。

图1 Western blotting检测各组LNCaP细胞凋亡相关蛋白和自噬相关蛋白表达

表1 各组LNCaP 细胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量比较（± s）

表1 各组LNCaP 细胞Caspase-3、LC3Ⅱ/LC3Ⅰ、Beclin1蛋白相对表达量比较（± s）

注：与si-NC组比较，①P＜0.05；与si-HOXA-AS3组比较，②P＜0.05；与si-HOXA-AS3+anti-miR-NC组比较，③P＜0.05。

组别si-NC组si-HOXA-AS3组si-HOXA-AS3+anti-miR-NC组si-HOXA-AS3+anti-miR-29a组Beclin1 0.18 ± 0.06 0.83 ± 0.10①0.82 ± 0.11①0.22 ± 0.09②③Caspase-3 0.26 ± 0.18 0.73 ± 0.14①0.75 ± 0.12①0.33 ± 0.10②③LC3II/LC3I 0.15 ± 0.07 0.74 ± 0.08①0.78 ± 0.10①0.16 ± 0.05②③

3 讨论

PCa 是男性第二常见的恶性肿瘤，约占男性所有癌症病例的15%。由于PCa的高发病率和强侵袭性，PCa 被认为是癌症相关死亡的主要原因之一，尤其是在发达国家。由于前列腺特异性抗原（PSA）检测的特异性较低，并且患者早期缺乏可识别的症状，很大一部分PCa 患者在晚期才被诊断出来，治疗效果欠佳，预后较差。近年来研究发现，遗传基因因素在PCa 的发病机制中发挥重要作用。然而，目前发现的PCa 相关癌基因和抑癌基因作用有限，无法解释PCa 复杂的发生及转移机制，因此尚缺乏有效的分子靶向治疗途径。

lncRNA 是一种内源性长链非编码RNA 分子，其本身无蛋白质编码功能，但其能以表观遗传学的形式调控其他基因表达，参与细胞增殖、凋亡、自噬等重要过程。既往研究发现，lncRNA 作为致癌因子或肿瘤抑制因子发挥作用，与肿瘤的发生发展有关，lncRNA 已被认为可能成为未来诊断、治疗肿瘤的潜力基因［10］。lncR-HOXA-AS3属于近期发现的HOXA家族成员之一，因其参与多种恶性肿瘤发生及耐药而受到关注［11-14］。lncR-HOXA-AS3 在PCa 发病机制中的研究极少。本研究结果显示，PCa 细胞中lncR-HOXA-AS3 表达异常升高，提示其可能作为致癌因子参与PCa的发病。

自噬是真核生物特有的，自噬和凋亡是维持机体正常的生理平衡和内环境稳定的重要机制，自噬是细胞程序性死亡的途径之一，与凋亡一样，在恶性肿瘤发生发展中起关键作用［15］。研究发现，lncRNA参与肿瘤细胞自噬和凋亡的调控［16］。本研究结果显示，沉默lncR-HOXA-AS3 表达，LNCaP 细胞凋亡率明显上升，凋亡调控关键蛋白Caspase-3、自噬相关蛋白LC3Ⅱ/LC3Ⅰ及Beclin 1 蛋白表达均明显升高，提示沉默lncR-HOXA-AS3 表达能促进LNCaP 细胞凋亡和自噬，lncR-HOXA-AS3 在PCa 发生进展中的作用与其对肿瘤细胞凋亡和自噬的调控有关。

lncRNA 在细胞调控中作用与其对下游靶基因的调控有关。研究发现，许多lncRNA 充当miRNA的内源性竞争性RNA 以调节不同途径的miRNA 靶向基因表达，从而调控细胞的生物学功能。近期在宫颈癌［17］和胃癌［18］研究中均发现，lncR-HOXA-AS3可靶向miR-29a 参与肿瘤细胞生物学特性的调控。miR-29a 是 miR-29 家族成员之一，其定位于人染色体7q32.3 的负链，在机体免疫反应、肿瘤形成等过程中发挥关键作用。近期研究表明，miR-29a 在肿瘤发生进展中发挥抑癌因子的作用［19］。目前研究已证实miR-29a 在PCa 细胞和组织中异常低表达，在PCa 的发生进展中起抑癌因子的作用。上调PCa 细胞中miR-29a表达能抑制Pca细胞增殖及转移，并促进其凋亡和自噬［20-23］。本研究结果显示，PCa细胞中miR-29a表达异常降低，与既往研究结果一致。且本研究通过双荧光素酶报告基因结果发现，lncRHOXA-AS3 能靶向miR-29a 抑制PCa 细胞的荧光素酶活性，沉默lncR-HOXA-AS3 表达可上调PCa 细胞中miR-29a表达，并且转染anti-miR-29a能降低PCa细胞中miR-29a表达，逆转沉默lncR-HOXA-AS3对PCa 细胞的凋亡和自噬的促进作用。提示抑制lncRHOXA-AS3 对PCa 细胞凋亡和自噬的促进作用，与其对miR-29a基因的靶向调控有关。

综上所述，Pca 细胞lncR-HOXA-AS3 呈高表达，miR-29a 呈低表达；抑制lncR-HOXA-AS3 能靶向调控miR-29a基因促进PCa细胞凋亡和自噬。