血清miR-223、IL-6水平与复杂型热性惊厥患儿脑损伤的关系

李婉晨，孙欣荣

1 西安医学院研究生院临床医学系，西安 710068；2 商洛市中心医院儿科；3 西安市儿童医院呼吸科

热性惊厥（FS）是一种以肢体颤抖或僵硬为主要临床表现的神经系统疾病，也是最常见的儿童惊厥原因，患病率为3%～5%［1］。复杂型热性惊厥（CFS）是小儿FS 最严重的类型，占20%～30%，惊厥发作频率较单纯型FS 增多，易导致脑损伤，给患儿生命健康造成严重后果［2］。CFS 患儿脑损伤机制复杂，但多项研究证实神经炎症反应在其中发挥重要作用［3］。微小核糖核酸（miRNA）能通过调控神经炎症反应参与FS 过程［4］。miR-223 是一种炎症反应相关的miRNA，已被报道可参与创伤性脑损伤、脑膜炎等神经炎症反应过程［5-6］。有学者通过分析FS 患儿miRNA 表达谱发现，miR-223 在FS 患儿血清中水平降低［7］。白细胞介素-6（IL-6）是一种炎症调节因子，能通过调节多种炎症细胞和信号通路促进神经炎症发生发展［8］。研究报道，IL-6 基因多态性与小儿FS 易感性有关［9］。然而关于血清miR-223、IL-6与CFS 患儿脑损伤的关系仍不明确。2021年1月—2023 年8 月，我们探讨了血清miR-223、IL-6 水平与CFS 患儿脑损伤的关系，以期为降低CFS 患儿脑损伤提供更多理论依据。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2021 年1 月—2023 年5 月我院收治的124 例CFS 患儿（CFS 组），CFS 组纳入标准：①年龄≤12 岁；②符合《热性惊厥诊断治疗与管理专家共识（2017实用版）》［10］CFS诊断标准；③首次发病；④经患儿监护人同意并签署同意书；⑤资料完整。排除标准：①其他FS类型；②合并脑膜炎、脑血管畸形、颅骨骨折、中毒性脑病、癫痫等神经系统疾病，或神经系统疾病史；③遗传代谢病、急性中毒等其他原因所致惊厥；④既往有惊厥发作史；⑤先天性免疫缺陷；⑥血液系统疾病；⑦恶性肿瘤患儿。CFS组男81 例、女43 例，年龄5 个月～7 岁，病程1～6 d；发热原因：中毒性菌痢者13例、急性胃肠炎者16例、上呼吸道感染者84 例、其他11 例。发热体温＜38.5 ℃者31 例、38.5～40 ℃者79 例、＞40 ℃者15例。另选取46例入院体检的健康儿童（对照组），纳入标准：无肝肾功能异常，无原发性心脏病、心脏瓣膜性疾病，无血液系统疾病、自身免疫系统疾病及其他代谢性疾病；排除标准：神经系统发育异常、神经发育迟缓、颅脑外伤及脑水肿。对照组男30 例、女16例，年龄6个月～7岁。两组年龄和性别具有可比性（P>0.05）。根据CFS患儿发病后2周内是否发生脑损伤将CFS患儿分为脑损伤组和无脑损伤组。惊厥性脑损伤定义：排除其他原因所致脑损伤，于惊厥发作后出现的精神神经症候群（神经症状、癫痫等），并经脑电图检查发现明显异常［11］。本研究经医院伦理委员会批准。

1.2 血清miR-223、IL-6 检测 收集CFS 组入院时和对照组体检时空腹静脉血2 mL，以1500×g 离心15 min（半径10 cm），取上层血清保存于两支试剂管中，一管使用北京兴怡雅创生物技术有限公司提供的酶联免疫吸附法试剂盒（编号：YAD8699）检测IL-6。另一管用TRIzol 法（上海联硕生物科技有限公司，编号：TRIzol 15596026）提取血清总RNA，鉴定纯度合格后（赛默飞世尔科技公司生产的ND-LITE-PR 紫外可见分光光度计），TaKaRa 法（上海北诺生物科技有限公司，编号：l111042）反转录为互补DNA。以互补DNA 为模板、U6 为内参，根据SYBR Green qPCR Master Mix 试剂盒（美国MCE，编号：HY-K0501A）说明书进行实时荧光定量聚合酶链式反应，血清miR-223 水平以2-ΔΔCT法计算。北京睿博兴科生物技术有限公司设计合成引物，miR-223正向引物5'-GGCAGCACCCCATAAACTGTT-3'，反向引物5'-CAGTGCGTGTCGTGTCGTGGAG-3'；U6正向引物5'-CGAATCCATTCAAATCCGGGATCCG-3'，反向引物5'-AAGGCATTCAATCGGACTTAC-3'。反应体积：互补DNA 2 μL、2×SYBR Green qPCR Master Mix 10 μL、正反向引物各0.8 μL、无菌超纯水加至总体积20 μL；反应条件：95 ℃ 10 min 1 次，95 ℃ 10 s、64 ℃ 10 s、72 ℃ 30 s 40次。

1.3 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。计量资料若为正态分布以±s±s表示，两组比较行t检验；若为偏态分布则以M（P25，P75）表示，两组比较行U检验。计数资料例（%）表示，比较行χ2检验；CFS 患者血清miR-223与IL-6水平的相关性用Spearman 相关性分析；影响CFS患儿脑损伤的因素用多因素Logistic 回归分析；血清miR-223、IL-6 水平对CFS 患儿脑损伤的预测价值用受试者工作特征（ROC）曲线分析，Delong 检验比较血清miR-223、IL-6 水平单独与联合预测CFS患儿脑损伤的曲线下面积（AUC）。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 CFS 组与对照组血清miR-223、IL-6 水平比较 CFS组与对照组血清miR-223水平分别为0.81 ±0.12、1.32 ± 0.21，IL-6 水平分别为25.48（14.36，37.40）、4.52（3.46，5.68）ng/mL。与对照组比较，CFS组血清miR-223水平降低，IL-6水平升高（P均＜0.05）。

2.2 CFS患者血清miR-223与IL-6水平的相关性Spearman 相关性分析显示，CFS 患儿血清miR-223与IL-6 水平呈负相关（r=-0.800，95%CI：-0.857～-0.723，P＜0.05）。

2.3 脑损伤组与无脑损伤组临床资料比较 124例CFS患儿发生脑损伤39例，脑损伤发生率为31.45%（39/124）。脑损伤组病程长于无脑损伤组，全身抽搐、发热体温>40 ℃、惊厥发作次数≥2次、惊厥发作持续时间≥5 min 比例和IL-6 水平高于无脑损伤组，miR-223水平低于无脑损伤组（P均＜0.05），两组其他资料比较差异无统计学意义（P均>0.05）。见表1。

表1 脑损伤组与无脑损伤组临床资料比较

2.4 影响CFS 患儿脑损伤的多因素Logistic 回归分析结果 以CFS患儿脑损伤（是/否=1/0）为因变量，以表1有统计学差异的因素（P＜0.05）：病程（原值录入）、抽搐范围（全身/局部=1/0）、发热体温（＜38.5 ℃/38.5～40 ℃/>40 ℃=1/2/3）、惊厥发作次数（≥2 次/＜2 次=1/0）、惊厥发作持续时间（≥5 min/＜5 min=1/0）、miR-223（原值录入）、IL-6（原值录入）为自变量，建立影响CFS 患儿脑损伤的多因素Logistic回归模型。结果显示，全身抽搐、惊厥发作次数≥2次、惊厥发作持续时间≥5 min、IL-6 升高为CFS 患儿脑损伤的独立危险因素，miR-223 升高为独立保护因素（P均＜0.05）。见表2。

表2 影响CFS患儿脑损伤的多因素Logistic回归分析结果

2.5 血清miR-223、IL-6 水平对CFS 患儿脑损伤的预测价值 绘制血清miR-223、IL-6水平单独与联合预测CFS患儿脑损伤的ROC曲线。血清miR-223、IL-6水平联合预测CFS患儿脑损伤的AUC为0.899，大于血清miR-223、IL-6 水平单独预测的0.803、0.780（Z分别为2.351、2.553，P均＜0.05）。见表3。

表3 血清miR-223、IL-6水平对CFS患儿脑损伤的预测价值

3 讨论

FS是由发热（腋温≥38 ℃或肛温≥38.5 ℃）引起的惊厥发作，主要由病毒感染所致，小儿由于神经系统发育不完善、神经兴奋易扩散或泛化，在发热后极易引起脑组织化学成分变化导致惊厥发作，尽管多数FS患儿惊厥发作时间短暂（1～3 min），病程具有自限性，预后较好，但CFS患儿惊厥发作时间较长且常反复发作，极易损伤神经系统功能导致脑损伤，甚至诱发癫痫［12-13］。发热是CFS的病理基础，但发热体温并不能较好地预测脑损伤发生，因此还需探索其他可靠指标，以促进脑损伤早期诊断，改善患儿预后。

神经炎症反应参与CFS 的发生发展，各种原因所致发热可激活和刺激神经系统中热原途径促炎细胞因子释放，导致神经炎症反应发生，神经炎症反应不仅能破坏体温调节中枢导致体温进一步上升，还能诱导神经元凋亡或引起神经元异常放电等导致脑损伤发生［14］。miRNA 能通过与靶基因mRNA 的3′-非翻译端中的互补序列结合来抑制靶基因的表达，从而调控神经炎症反应［15］。miR-223 定位于人染色体Xq12，近年来研究报道其与神经炎症反应有关。在缺血再灌注建立的急性脑梗死大鼠模型中，上调miR-223 能减少脑组织炎性细胞因子释放，抑制神经系统炎症反应［16］。在慢性不可预知性温和应激建立的抑郁小鼠模型中，上调miR-223 能抑制NOD 样受体热蛋白结构域相关蛋白3（NLRP3）信号通路抑制海马组织炎症反应［17］。上述研究提示miR-223 具有抑制神经炎症反应的作用。WU 等［18］实验报道，上调miR-223 表达能抑制神经元凋亡，缩短大鼠惊厥持续时间。同时有报道指出，FS 患儿血清miR-223水平降低［7］。因此推测血清miR-223可能与CFS患儿脑损伤有关。本研究结果显示，CFS 患儿血清miR-223 水平降低，miR-223 升高为CFS患儿脑损伤的独立保护因素，提示血清miR-223水平升高能降低CFS患儿脑损伤风险，其机制可能与miR-223能抑制NLRP3/半胱天冬酶-1（Caspase-1）信号通路有关。NLRP3/Caspase-1 是神经炎症反应重要信号通路，能促进促炎细胞因子转录并介导细胞焦亡［19］。最近WANG 等［20］实验报道，上调miR-223 表达能抑制NLRP3/Caspase-1 信号通路激活，减少海马神经元炎症损伤和凋亡，进而减轻大鼠惊厥发作，并提升学习记忆能力。

IL-6 是由多种细胞表达的一种可溶性蛋白，生理状态下呈低表达，在各种病理刺激下可大量释放，通过结合IL-6受体和糖蛋白130（gp130），启动Janus激酶（JAK）磷酸化，以此激活JAK/信号转导及转录激活蛋白（STAT）参与炎症反应过程［21］。研究报道，IL-6参与脑缺血再灌注损伤、阿尔茨海默病、癫痫等神经炎症疾病过程［22-24］。实验报道，IL-6 在FS 小鼠脑组织中高表达，下调IL-6能缩短惊厥持续时间［25］。临床研究指出，CFS 患儿血清IL-6 水平较单纯型FS升高［26］。然而关于血清IL-6水平与CFS患儿脑损伤的关系尚不明确。本研究结果显示，CFS 患儿血清IL-6 水平升高，IL-6 升高为CFS 患儿脑损伤的独立危险因素，提示血清IL-6 水平升高会增加CFS 患儿脑损伤风险，其机制可能是IL-6 能激活JAK/STAT信号通路，引发炎症级联反应，加重神经炎症反应，导致CFS 患儿脑损伤风险增加［27］。此外，IL-6 作为一种致热原性的细胞因子，其水平升高可进一步破坏体温调节中枢，加剧神经功能损害而增加CFS 患儿脑损伤风险［14］。WANG 等［28］研究显示，抑制FS小鼠海马IL-6表达能改善脑损伤。

本研究相关性分析发现，CFS患儿血清miR-223与IL-6 水平呈负相关，说明miR-223 与IL-6 可能共同参与CFS 过程，考虑原因可能与miR-223 能抑制NLRP3/Caspase-1 信号通路减少IL-6 表达有关［19］。二者具体关系还需进一步实验证实。本研究结果显示，全身抽搐、惊厥发作次数≥2 次、惊厥发作持续时间≥5 min 为CFS 患儿脑损伤的独立危险因素，其可能原因：全身抽搐、惊厥发作次数越多、惊厥发作持续时间越长反映CFS 患儿病情更严重，因此脑损伤风险更高。本研究ROC 曲线显示，血清miR-223、IL-6 水平最佳截断值为0.82、24.85 ng/mL 时，预测CFS 患儿脑损伤的AUC分别为0.803、0.780，血清miR-223、IL-6 水平联合预测的AUC为0.899，较血清miR-223、IL-6水平单独预测显著升高。提示血清miR-223、IL-6 水平可能成为CFS 患儿脑损伤的辅助预测指标，有助于指导临床制定措施降低CFS 患儿脑损伤风险。

综上所述，CFS患儿血清miR-223水平降低，IL-6水平升高，与脑损伤发生密切相关；血清miR-223、IL-6 水平联合对CFS 患儿脑损伤的预测价值较高。但本研究存在选择偏倚和样本量小等不足，有待进一步扩大样本量研究。