LEASO 患者血清miR-21、miR-126水平与HMGB1/TLR4信号通路活性和术后复发的关系

李雪松，刘一东，肖永生，刘喆，张芊慧

天津第四中心医院血管外科，天津 300140

下肢动脉硬化闭塞症（LEASO）是动脉粥样硬化（AS）引起的下肢供血动脉狭窄或闭塞，股腘型是LEASO 最常见类型，严重影响患者生活质量［1-2］。血管腔内介入是LEASO 首选治疗方法，但术后复发率仍较高［3］。了解股腘型LEASO 介入术后复发的影响因素，对降低术后复发非常重要。研究表明，高迁移率族蛋白B1（HMGB1）/Toll 样受体4（TLR4）信号通路介导的炎症反应参与LEASO 发生发展［4-5］。微小核糖核酸（miR）能通过调控炎症反应参与LEASO 发生发展［6］。miR-21、miR-126 是一种炎症相关miRNA，能通过调控多种基因表达参与炎症过程［7-8］。有实验指出，miR-21 与miR-126 能分别通过影响血管平滑肌细胞功能与血管内皮功能参与LEASO 发生［9-10］。然而关于血清miR-21、miR-126 表达与股腘型LEASO 患者术后复发的关系尚不明确。2020 年1 月—2023 年3 月，我们探讨了股腘型LEASO 患者血清miR-21、miR-126 水平与HMGB1/TLR4 信号通路活性和术后复发的关系。

1 资料与方法

1.1 临床资料 选取2020 年1 月—2021 年3 月在天津市第四中心医院行介入手术的股腘型LEASO患者120 例，本研究经天津市第四中心医院伦理委员会批准（编号：K2019-524）。其中男71 例、女49例，年龄41～76（59.84 ± 8.10）岁；泛大西洋协作组织共识Ⅱ（TASCⅡ）分型［11］：A 型23 例、B 型28 例、C型49 例、D 型20 例。纳入标准：①年龄>40 岁；②患者或家属签署同意书；③符合《下肢动脉硬化闭塞症诊治指南》［12］LEASO 诊断标准，且经影像学检查为股腘动脉闭塞症；④首次接受介入手术治疗；⑤彩色多普勒超声或CT血管成像检查血管狭窄超过50%；⑥介入手术成功。排除标准：①合并下肢骨折；②髂动脉、股动脉LEASO；③妊娠及哺乳期女性；④介入手术禁忌证（如严重凝血功能障碍、碘过敏等）；⑤免疫性疾病和恶性肿瘤；⑥精神异常；⑦急性肢体缺血、多发性大动脉炎、血栓闭塞性脉管炎等其他动脉疾病。股腘型LEASO 患者入院后均接受介入手术治疗，出院后通过电话、门诊等方式随访2年，每6个月1 次，随访截至2023 年3 月或术后复发。术后复发定义为随访期间数字减影血管造影发现支架管腔血管狭窄超过50%［13］。根据术后是否复发将股腘型LEASO患者分为复发组和未复发组。

1.2 血清miR-21、miR-126 和外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达检测 收集股腘型LEASO患者介入术前1 d空腹外周静脉血6 mL，保存于两管试剂管中，其中一管以10 cm半径，3 000 r/min离心10 min，取上层血清保存于－80 ℃冰箱中用于血清miR-21、miR-126 检测；另一管肝素钠抗凝后，通过密度梯度离心法分离外周血单个核细胞用于外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表达检测。使用TRIzol 总RNA 提取试剂盒（上海冠泰生物科技有限公司）提取血清和外周血单个核细胞中总RNA，紫外分光光度计［岛津企业管理（中国）有限公司，型号：UV-3600i Plus］完成RNA 浓度和纯度合格鉴定后，使用TaKaRa 反转录试剂盒［宝日医生物技术（北京）有限公司］反转为互补RNA，反应条件：40 ℃ 60 min、70 ℃ 5 min。由南京金斯瑞生物科技股份有限公司完成引物设计和合成，将收到的引物用无酶水溶解后，参考实时荧光定量聚合酶链式反应试剂盒（湖南艾科瑞生物工程有限公司）说明书，取1 μL反转录产物为模板，加入10 μL 2×荧光定量聚合酶链式反应液、0.5 μL上反向引物、7.5 μL无酶去离子水，混合均匀后置于聚合酶链反应系统［赛默飞世尔科技（中国）有限公司，型号：ProFlex™］进行反应。反应条件：95 ℃ 5 min 1 次，95 ℃ 30 s、60 ℃30 s、72 ℃ 60 s 40 次。miR-21、miR-126 以U6 为内参校正，HMGB1、TLR4 以GAPDH 为内参校正，采用2-ΔΔCT法计算miR-21、miR-126、HMGB1、TLR4相对表达量。miR-21 正向引物5'-TCGGCAGGU GGUGGGCCGCAG-3'，反向引物5'-CACTCAACTGGTGTCGTGGA-3'；miR-126 正向引物 5'-TGCAACATCATCTGCTCCCA-3'，反向引物5'-CTGAATAACTGATGGCTGGGC-3'；U6 正向引物5'-CTCGCTTCGGCAGCACA-3'，反向引物5'-AACGCTTCACGAATT TGCGT-3'；HMGB1 正 向 引 物 5'-GAAAGCGCAAGTCTTCAAAG-3'，反向引物5'-TGGGTAGGAGATGGAGATGC-3'；TLR4 正向引物5'-GGACTCTCGCTGGTCTACCT-3'，反向引物5'-GGGCACAATATGCAGGCAGA-3'；GAPDH 正向引物5'-CAAGGTCATCCATGACAACTTTG-3'，反向引物5'-GTCCACCACCCTGTTGCTGTAG-3'。

1.3 统计学方法 采用SPSS28.0 统计软件。计量资料符合正态分布以±s表示，比较采用t检验；偏态分布的计量资料以M（P25，P75）表示，两组比较行U检验；计数资料比较采用χ2检验。股腘型LEASO 患者血清miR-21、miR-126 与外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表达的相关性采用Pearson相关法进行分析；影响股腘型LEASO患者介入术后复发的因素采用多因素Logistic 回归分析。P＜0.05为差异有统计学意义。

2 结果

2.1 复发组与未复发组血清miR-21、miR-126 和外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表达比较 随访2 年，120 例股腘型LEASO 患者术后复发41 例，复发率为34.17%（41/120）。复发组血清miR-21 和外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表达高于未复发组，血清miR-126 表达低于未复发组（P＜0.05）。见表1。

表1 复发组与未复发组血清miR-21、miR-126和外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达比较（± s± s）

表1 复发组与未复发组血清miR-21、miR-126和外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达比较（± s± s）

组别复发组未复发组n 41 79 t P miR-21 1.82 ± 0.35 1.46 ± 0.34 7.216＜0.05 miR-126 0.36 ± 0.07 0.44 ± 0.06-7.051＜0.05 HMGB1 mRNA 1.42 ± 0.18 1.23 ± 0.17 6.478＜0.05 TLR4 mRNA 2.74 ± 0.18 2.53 ± 0.18 6.738＜0.05

2.2 血清miR-21、miR-126 与外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA表达的相关性 Pearson相关法分析显示，股腘型LEASO患者血清miR-21与外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表达呈正相关（r分别为0.660、0.649，P均＜0.05），miR-126 与外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表达呈负相关（r分别为－0.632、－0.641，P均＜0.05），外周血单个核细胞HMGB1 mRNA 与TLR4 mRNA表达呈正相关（r=0.742，P＜0.05）。

2.3 股腘型LEASO 患者介入术后复发组与未复发组临床资料比较 两组性别、年龄、TASCⅡ分型、饮酒、高脂血症、冠心病、完全闭塞、血管病变长度、术前实验室指标、支架数量和支架长度比较差异无统计学意义（P均>0.05），复发组吸烟、高血压、糖尿病和单纯球囊扩张比例高于未复发组（P均＜0.05）。见表2。

表2 复发组与未复发组临床资料比较

2.4 影响股腘型LEASO 患者介入术后复发的多因素Logistic回归分析结果 高血压、糖尿病和miR-21、HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 升高为股腘型LEASO患者介入术后复发的独立危险因素，miR-126 升高为独立保护因素（P均＜0.05）。见表3。

表3 影响股腘型LEASO患者介入术后复发的多因素Logistic回归分析结果

3 讨论

血管腔内介入是股腘型LEASO 患者的重要治疗手段，能有效重建血运，缓解肢体溃疡坏疽、静息痛、间歇性跛行为等症状，但仍有部分患者术后动脉再次狭窄甚至闭塞［14］。

HMGB1是一种高度保守核蛋白，能通过与髓样分化蛋白2 结合激活TLR4 复合物形成HMGB1/TLR4 信号通路，并由此活化核因子-κB（NF-κB），促进大量炎性细胞因子释放，且HMGB1/TLR4 是AS发生发展的关键炎症信号通路之一［15］。本研究结果显示，股腘型LEASO 患者外周血单个核细胞HMGB1 mRNA 与TLR4 mRNA 表达呈正相关，提示HMGB1/TLR4 信号通路在股腘型LEASO 患者中处于激活状态。结果还显示，复发组外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 表达升高，是股腘型LEASO 患者术后复发的独立危险因素，说明HMGB1/TLR4 信号通路激活参与股腘型LEASO 术后复发。

miR-21 最初于肿瘤细胞中检测发现，近年研究发现，miR-21 能通过调控免疫细胞或靶基因参与炎症反应过程，在冠心病、急性脑梗死等AS 相关疾病中发挥重要作用［16-17］。贾敏等［18］研究报道，miR-21表达上调能促进内皮细胞炎症反应，进而促进载脂蛋白E敲除小鼠AS发生发展。miR-126定位于人染色体9q34.3，由于其特异性表达于血管内皮细胞，并通过抑制炎症发挥血管内皮保护作用，因此被认为是心血管疾病的保护因子［19］。SHOU 等［20］研究报道，miR-126 在氧化低密度脂蛋白建立的泡沫细胞中低表达，上调miR-126 能抑制泡沫细胞发育和巨噬细胞向促炎表型转换，进而抑制AS形成。上述研究表明，miR-21、miR-126 可通过炎症反应参与AS形成。本研究结果显示，复发组血清miR-21 表达升高，且是股腘型LEASO 患者介入术后复发的独立危险因素；血清miR-126 表达降低，而其表达升高是股腘型LEASO 患者介入术后复发的独立保护因素，说明二者与股腘型LEASO 患者介入术后复发密切相关。分析原因可能是miR-21 高表达能通过丝裂原活化蛋白激酶1/2 通路激活炎症，促进平滑肌细胞表型转换而导致AS 形成，增加股腘型LEASO 患者介入术后复发风险［9］；miR-126高表达通过磷脂酰肌醇3-激酶/蛋白激酶B 抑制炎症反应，减轻血管内皮细胞损伤和凋亡，进而降低股腘型LEASO 患者介入术后复发风险［10］。

本研究结果还发现，股腘型LEASO 患者外周血单个核细胞HMGB1 mRNA、TLR4 mRNA 与血清miR-21表达呈正相关，与miR-126表达呈负相关，提示miR-21 高表达和miR-126 低表达可能通过HMGB1/TLR4 信号通路影响股腘型LEASO 患者术后复发。LIU 等［21］研究显示，上调miR-126能靶向下调HMGB1 及其反向促炎基因表达，改善缺氧酸中毒诱导的血管内皮细胞炎症损伤。此外本研究结果还发现，高血压、糖尿病也会增加股腘型LEASO 患者介入术后复发风险。分析原因可能是持续血压升高和高血糖会加剧血管壁损伤，激活血管壁炎症反应导致AS形成，进而导致术后复发风险增加［22］。

综上所述，血清miR-21 高表达和miR-126 低表达与股腘型LEASO 患者HMGB1/TLR4 信号通路激活有关，且血清miR-21高表达是股腘型LEASO患者术后复发的独立危险因素，miR-126 低表达是保护因素。