基于网络药理学探讨紫苏子—杏仁药对治疗咳嗽变异性哮喘的作用机制

王卉,赵克明

咳嗽变异性哮喘(CVA)主要临床表现为咳嗽,是慢性咳嗽的主要病因,为临床上一种较为特殊的哮喘类型。CVA与典型支气管哮喘具有相似的病理生理特征,但疾病的程度相对较轻[1]。现代医学对于CVA的治疗多运用茶碱类、白三烯受体拮抗剂、糖皮质激素、β受体激动剂等药物以改善临床症状[2],但部分患者激素治疗的依从性低,症状控制不理想,且部分患者有停药后复发的风险。现如今研究中药治疗疾病的潜在分子机制多应用网络药理学,其能通过相关算法整合中药成分数据库、疾病数据库、靶标数据库,结合医学、药理学、系统生物学等多个学科,以此阐释中药治疗疾病的机理。基于以上优势,本研究拟应用网络药理学分析建立紫苏子—杏仁药对活性成分间的互作网络,从中筛选出与治疗CVA相关的活性成分,预测这些成分的作用靶点,为其进一步药理作用研究及临床应用提供参考。

1 资料与方法

1.1 紫苏子—杏仁药对有效活性成分筛选及靶点预测 以类药性(DL)≥0.18,口服生物利用度(OB)≥30%作为标准,通过中药系统药理学数据库和分析平台(TCMSP,https://tcmspw.com/tcmsp.php)数据库检索并筛选紫苏子—杏仁药对的活性成分。通过Pubchem数据库(https://pubchem.ncbi.nlm.nih.gov/)搜索已筛选的每个活性成分的分子结构及名称并进行核对,再利用SwissTargetPrediction网站(http://www.swisstargetprediction.ch/)预测其可能存在的作用靶点。

1.2 疾病潜在作用靶点的筛选 登录GeneCards数据库(https://www.genecards.org/),检索“cough variant asthma”得到CVA相关疾病靶点。

1.3 构建“药物—活性成分—共同靶点”网络图 将预测的药物成分靶点和疾病靶点导入Venny 2.1.0(https://bioinfogp.cnb.csic.es/tools/venny/index.html)绘制韦恩图,得到紫苏子—杏仁药对的有效活性成分靶点和CVA靶点的交集。将交集靶点输入CytoScape 3.9.1(https://cytoscape.org),得到并可视化“药物—活性成分—共同靶点”网络。使用网络分析插件CytoNCA,关注节点的度中心性,度值越大代表相关的生物功能越多,重要性就越高。

1.4 PPI网络建立及其核心蛋白筛选 将交集靶点导入STRING数据库(https://cn.string-db.org/cgi/input.pl),物种设置为Homo Sapiens(智人),得到PPI蛋白互作网络图,使用Cytoscape的“centiscape 2.2”插件,以度中心性、中介中心性、接近中心性≥阈值为条件,筛选出合适的节点,再次构建PPI,并通过Cytoscape 3.9.1软件将其可视化。

1.5 GO功能分析及KEGG通路富集分析 交集靶点导入将DAVID数据库(https://david.ncifcrf.gov/)对其进行GO功能及KEGG通路富集分析,物种限定为人类,得到GO功能和KEGG通路的富集分析。GO功能富集分析包括分子功能(MF)、细胞成分(CC)和生物学过程(BP),以P<0.05进行筛选排序,利用微生信平台作图(http://www.bioinformatics.com.cn/),以气泡图表示,对结果进行可视化分析。

2 结 果

2.1 紫苏子—杏仁药对有效活性成分与CVA相关靶点 以DL≥0.18、OB≥30%作为筛选条件,利用TCMSP数据库进行筛选,得到杏仁有效活性成分19个,紫苏子有效活性成分16个,其中未预测到相应靶点的有效活性成分3个,进一步筛选后得到有效成分32个,靶点426个。在GeneCards数据库内检索与CVA相关基因,共得到靶点基因3 229个。将紫苏子—杏仁药对有效活性成分靶点与CVA相关靶点取交集,共获得交集靶点224个,以韦恩图表示,见图1。

图1 紫苏子—杏仁药对与CVA的交集靶点韦恩图

2.2 “药物—活性成分—共同靶点”网络分析 将紫苏子—杏仁药对的活性成分数据和相应靶点数据,以及交集靶点数据导入Cytoscape 3.9.1,构建“药物—活性成分—共同靶点”网络图,见图2。此网络共有节点255个和953条边,节点代表作用靶点及活性成分,两个“V”形代表紫苏子与杏仁两味药物,“△”是紫苏子与杏仁的活性成分,“◇”是224个共同靶点,连线代表相互关联。图中节点的大小代表的是度值的大小,度值越大,其对应的节点越大,可以交互的靶点数更多,在网络中的重要性也就越高。从化合物角度,排名前6位的化合物依次为花生四烯酸、甘草醇、甘草苷、木犀草素、11,14-二十碳二烯酸、菠甾醇,可能是紫苏子—杏仁药对治疗CVA的关键化合物。从图2中可以发现,多个靶点可以与同一个活性成分相关联,一个靶点也可关联单个或多个活性成分,这说明紫苏子—杏仁药对可能是通过多成分、多靶点的联合起到对CVA的治疗作用。

图2 紫苏子—杏仁药对的“药物—活性成分—共同靶点”网络图

2.3 PPI蛋白互作网络分析 在STRING数据库在线平台导入224个交集靶点,下载潜在靶点蛋白互作关系文件,将其输入Cytoscape 3.9.1软件,通过插件centiscape 2.2的“network analysis”功能,以度中心性≥25.723 214 29、中介中心性≥253.080 357 1、接近中心性≥0.002 138 077为筛选条件,拓扑筛选后获得44个核心靶点,根据新的44个核心靶点再次建立PPI网络图,见图3。根据度值大小排名前10位的靶点为AKT1、IL-6、TP53、SRC、MAPK3、EGFR、JUN、PTGS2、HSP90AA1、ESR1。

图3 PPI蛋白互作网络图

2.4 GO功能与KEGG通路富集分析 在DAVID数据库输入224个交集靶点进行GO功能富集分析,以P<0.05筛选后,共得到分子功能(MF)165个、细胞组分(CC)79个、生物过程(BP)630个,选择前20个条目使用微生信进行绘图,见图4。图中节点的大小由相关联基因数决定,节点从小到大表明关联基因的数量从少到多。对紫苏子—杏仁药对治疗CVA的靶点进行KEGG通路富集分析,共涉及通路155条,取前20条绘图,见图5。显著性通路主要涉及PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路、神经活性配体—受体相互作用、癌症通路、化学致癌—受体激活通路等。

MF

图5 紫苏子—杏仁药对治疗CVA预测靶点的KEGG通路富集图

3 讨 论

CVA并非由单一的因素引起,中医学虽并无CVA的病名记载,但在既往典籍中有类似症状的记载,《内经》云:“五脏六腑皆令人咳,非独肺也”,如今很多医者认为CVA的病机关键在风、痰、虚、瘀,尤其以风邪为主[3]。现代研究认为气道高反应性、变异性致敏源、气道炎性反应和气道重塑等与CVA的发病密切相关[4]。

本研究通过对“中药—活性成分—疾病靶点”网络构建发现,抗CVA的主要活性成分可能为花生四烯酸、甘草醇、甘草苷、木犀草素、11,14-二十碳二烯酸、菠甾醇。花生四烯酸被脂氧合酶代谢可能导致白三烯形成,引起支气管收缩、气道重塑、支气管高反应性和嗜酸性粒细胞浸润等[5-6]。木犀草素可降低卵清蛋白(OVA)致敏小鼠的气管支气管收缩和支气管气道高反应性,从而减轻实验小鼠的症状[7]。龚国清等[8]研究证明木犀草素可改善支气管炎性反应的严重程度,其是通过抑制TGF-β1mRNA的表达来实现。还有研究表明木犀草素的抗炎机制可能是通过抑制COX-2信号通路、调节Th1/Th2平衡等途径来实现,其可通过降低血清特异性IgE水平减少哮喘的气道高反应性[9-10]。木犀草素还可通过下调miR-132缓解气道支气管收缩和降低气道高反应性[11]。

在PPI网络中筛选出前10个核心基因,并按度值排序如下AKT1、IL-6、TP53、SRC、MAPK3、EGFR、JUN、PTGS2、HSP90AA1、ESR1。有研究表明,AKT1可成为CVA的治疗靶点是通过其靶向下调CD38的表达,推动平滑肌细胞的分化增殖来实现[12]。IL-6是目前发现的功能最广泛的细胞因子之一,其作为炎性递质具备促炎与抗炎双重作用,且能参与调节免疫反应、细胞增殖分化等[13]。相关研究证实TP53基因多态性与哮喘易感性相关[14]。SRC激酶是非受体酪氨酸激酶,其缓解哮喘的发作是通过遏制其活性,阻遏淋巴细胞的活化与增殖,从而减少炎性反应实现的[15]。MAPK3的活化会导致支气管上皮细胞发生炎性反应[16]。研究发现当机体受到病毒感染时,早期c-Jun蛋白可表达且调节CD4+和CD8+T细胞增殖和炎性反应,而JUN正是编码c-Jun蛋白的基因[17]。HSP90AA1可在炎性反应、细胞凋亡信号转导途径、减少钙超载等方面发挥调节作用[18]。ESR1基因变异可能会影响哮喘患者气道高反应性的发展,且可加速女性患者肺功能恶化,雌激素影响肺的发育及气道重塑可能是其发生机制[19]。

GO功能BP分析发现,关键靶点主要参与细胞凋亡过程负调控、对脂多糖的反应、RNA聚合酶Ⅱ启动子转录的正调控及负调控、细胞增殖的正向调节、信号转导、炎性反应、蛋白质磷酸化等。有研究表明,在亚洲沙尘导致的过敏性气道炎性反应中,脂多糖可强化中性粒细胞的聚集,使过敏性气道炎性反应加重[20]。CC分析发现关键靶点基因主要作用于质膜、胞质溶胶、质膜的组成成分、质膜固有成分等。MF分析发现,关键靶点基因主要参与蛋白质结合、相同蛋白质结合、蛋白丝氨酸/苏氨酸/酪氨酸激酶活性、锌离子结合、酶结合、金属离子结合、蛋白激酶活性等。

通过KEGG通路富集分析发现,紫苏子—杏仁药对治疗CVA的关键通路有PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路、癌症通路、化学致癌—受体激活通路、神经活性配体—受体相互作用等。PI3K-Akt信号通路在哮喘气道重塑中起到重要作用,与其能够推动气道平滑肌细胞的增殖密切相关[21]。通过抑制PI3K-Akt信号通路可减少气道上皮细胞的上皮—间质转化,以达到抑制气道重塑的目的[22]。神经活性配体—受体相互作用信号通路与哮喘的异质性炎性反应密切相关,是质膜上所有与细胞内外信号通路相关的受体和配体的集合[23]。cAMP调控着细胞的多种生理和病理效应,因为其作为细胞内的第二信使与多条信号通路密切相关[24]。糖皮质激素及β受体激动剂等哮喘治疗药物的作用发挥机制,一般与其影响cAMP信号通路的活性关系密切[25]。

综上所述,紫苏子—杏仁药对存在花生四烯酸、甘草醇、甘草苷、木犀草素等活性成分,通过调控神经活性配体—受体相互作用通路、PI3K-Akt信号通路、cAMP信号通路等,作用于AKT1、IL-6、TP53、SRC、MAPK3、EGFR、JUN、PTGS2、HSP90AA1、ESR1等靶点,调控多个途径、多个靶点协同来干预细胞代谢的多个过程,从而有效治疗CVA。但本研究主要依托于数据库信息,后续仍需进一步体外实验验证。

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