双光子显微成像系统的应用及开放管理模式探索

冯婉倩

（温州医科大学科研实验中心，浙江温州 325035）

传统的单光子显微成像技术利用400～700nm的可见光进行Z轴向激发，激光照射在标本上，染料分子吸收单个光子发射出荧光。在此基础上，激光共聚焦系统通过引入共轭小孔，在一定程度上去除了非焦平面的杂散光，提高了成像分辨率，但在成像深度方面仍有很大的限制。通常，我们利用共聚焦技术观察的普通标本厚度不超过200μm，透明化标本的厚度不超过500μm。相比之下，多光子显微成像技术通过点激发荧光显著提高了成像深度，使得观察活体标本的深度可达800μm，透明化标本厚度最大可达8mm。同时，该技术具有天然的切片效果，且空间分辨率几乎没有损失，其XY轴分辨率可达200nm，Z轴分辨率最大为500nm。因此，多光子显微镜在大小鼠、兔、斑马鱼、果蝇等模式动物活体XYZT多序列成像方面具有显著的应用优势，已成为研究胚胎、不同组织和器官中各种类型细胞的形态与功能的有用工具。尽管多光子显微镜的光损伤小，但其热毒性较高，相较于共聚焦技术的成熟稳定，还需进一步摸索条件。活体样本通过转基因、病毒标记、免疫荧光标记、小分子探针标记、血管注射染料等方法进行标记，操作复杂，需手术暴露成像部位，成像效果在很大程度上依赖于实验技能水平。本文通过总结多光子显微镜的配置参数、成像特点、工作原理及在不同应用中的操作特点，能够更好地服务于教学和科研。

温州医科大学已建成国家级工程中心、省部共建国家重点实验室以及省部级重点实验室等多个重点研究平台。学校现有的医学遗传学重点实验室、模式生物技术应用重点实验室、临床检验诊断、中医药研究院、基因组学研究院、分析测试中心等多个科研平台在前期已建立较为完善的科研体系。近年来，科研实验中心大型仪器平台的建立与运行为学校和附属医院的科研发展、疾病防治和精准治疗提供了支持。目前，平台配置了一台OLYMPUS正置双光子显微镜（FVMPERS），配备了两台光谱物理红外飞秒脉冲激光器，型号分别为Insight X3和Mai Tai Deepsee，波长分别在680～1 300nm和690～1 040nm可调，具备双光子激发、同步双扫、四轴校准、三维拼接四大重要技术。该仪器自装机以来，使用率高，总使用次数达1 600余次，服务时长超过2 100小时，用户主要分布在药学院分析测试中心、眼视光医院、基础医学院、第一和第二临床医学院、公共卫生与管理学院等机构，涵盖了药学/药理学（神经药理学）、药物分析、药剂学、生物材料与再生医学、光控视觉发育和脑功能的分子机制、急性肺损伤的炎症消退机制等多个研究方向，满足了校内外众多课题组在基础研究方面的需求。

一、双光子显微镜发展概况

20世纪90年代，Denk等人[1]发明了第一台双光子显微镜，并首次应用于生物样本。此后，双光子技术在生物医学研究中的应用取得了爆炸性的增长。双光子显微成像基于多光子吸收理论，即荧光基团在同时吸收两个光子的能量后被激发，当受激电子回到基态时，大部分能量以荧光形式发射的过程。在这个过程中，红外飞秒脉冲激光器提供了高强度、非线性、长波长（＞700nm）的近红外激光，使得激发的发射光被高数值孔径的物镜限制在焦点周围，激发体积通常小于毫微微升。此外，双光子显微镜的瞬时能量更高，导致其吸收谱线更宽，单个激发光可激发出不同的荧光。因此，双光子显微镜可以基于组织成分的内源性属性差异，进行无标记成像来观察组织自发荧光。目前，商业化定制或半定制的可调谐锁模钛蓝宝石近外飞秒激光器已替代可见激光源，在商品化的双光子激光扫描显微镜中被大量引入，推动多光子显微镜技术在更广泛的生物医学研究领域的扩展[2]。

双光子显微镜以其高信噪比和优越的生物组织穿透深度，结合三维层扫描分辨率的优点，成为重要的活体成像技术。许多活体神经生理过程的观察和体内微环境的动态变化都需要毫秒级的扫描速度。现代双光子仪器利用声光转换器代替检流计，能将扫描速度提高几个数量级，对于活体观察具有非常好的优化特性。我们利用声光转换器代替检流计能显著提高扫描速度，为活体观察提供了非常好的优化特性。活体成像面临的另一大难题是随着深入活体组织样本，不可避免地会出现荧光标记减弱的问题。为了解决这一问题，研究和应用各类专用于红外校正的高数值孔径、长工作距离物镜及高灵敏度检测器已成为当前的主要发展方向，更利于双光子显微镜在活体观察中的应用。

近年来，双光子显微镜还被广泛结合多种仪器应用于观察多种生理状态下不同疾病模型的变化及作用。例如，双光子显微镜与二次谐波（second harmonic generation，SHG）显微镜结合，可以对胶原蛋白等具有特定序列排列的结构蛋白进行成像，在糖尿病、老化、癌症等病理学和生理学研究上发挥重要作用。双光子显微镜结合荧光寿命成像（FLIM）配件可以测量溶液离子浓度、折射率等参数[3]。双光子显微镜结合膜片钳技术可以改进活体脑组织切片神经元深层成像效果。此外，双光子显微镜还能与等离子激光共振效应结合[4]，提高非线性过程的信号强度。因此，其在材料科学方向也展现出深远的应用前景。

二、双光子显微技术的应用

（一）双光子显微镜获取活体血流图像操作

为了获取活体血流图像，建立一个稳定的观察窗口是进行活体实验的前提，因此隔离活体动物呼吸和心跳的影响是尤为重要的。真空负压装置能够吸附器官和软组织，有效地防止活体器官组织在显微成像时发生抖动。使用者需调整活体成像器官固定仪吸附探头的角度和位置到样本上方，再通过调节旋钮让吸盘与组织完全贴紧直至吸力稳定，在调节过程中要避免压力过大导致血流因人为因素停滞或减缓，否则可能影响实验结果的判断。

双光子专用FV31S-SW软件的观察方法如下：首先点击IR Laser Immision打开激光，并在激光设置界面输入拟使用的激发光波长。两台激光器能够发出不同波段的近红外光，激发多种染料的荧光，有效避免各个染料之间发生串色现象。X3激光器适用于激发各类荧光蛋白成像，而Mai Tai激光器因其脉宽更窄，适用于深层成像和刺激，可用于激发组织自发荧光以显示血管结构。通道参数的设置需切换到检测器控制面板，勾选所需的检测通道，打开平均线性降噪和防串色功能，扫描分辨率选择512X512（全画幅）像素，将采集速度控制在2μs/pix左右，上述参数的应用通常能够获得较高信噪比的图像。荧光强度的调节可以通过改变激光强度和检测器电压实现，同时使目标样品到达最佳焦平面，激光功率越高，信号越强，但也更容易使染料发生淬灭。一般情况下，我们推荐活体实验的激光功率在不高于20%范围内调节，同等条件下，建议优先调节检测器电压HV值。最后时间序列扫描功能在Time Lapse设置模块进行设置，需设置的参数包括拍摄的图像数量Cycles，并点击Acquire进行获取以及采集完成后，可再选择一定数量的微血管（测量直径≤10μm）进行线扫描，从而完成对血流速度的量化分析[5]。

（二）双光子显微镜脑成像技术要点

大多数脑科学研究样品为脑组织切片或离体培养的神经元细胞，无法全面地反应大脑在三维空间内微环境的结构与功能。因此，实现活体皮层的高分辨率成像对于理解大脑血管、神经网络动态变化规律以及情感、记忆之间的联系具有重要意义。大脑皮层由大量的神经元和胶质细胞组成，其上方被颅骨组织包覆。颅骨的致密结构具有强烈的散射效应，是观察脑皮质血管结构和分析神经元信号的主要障碍。为了克服这一障碍，传统的颅骨清除方法，包括开窗法和磨骨法，虽然在一定程度上能满足研究要求，但具有局限性。例如，开颅窗很难避免相关的炎症反应，由于骨的再生，实验人员需要反复将颅骨磨薄至25μm以下，对实验技能要求较高，且无法实现无创的脑光学成像。相对而言，活体颅骨透明化方法允许进行大面积重复成像，几乎不引起皮层损伤和炎症，代表了一种新型的、安全有效且易于处理的颅窗技术[5]（如表1）。近年来，活体光透明化试剂的进一步发展为双光子显微技术在生物医学光学成像领域的应用提供了重要手段。透明化试剂的作用包括软化颅骨和匹配折射率两个方面，其成分通常包括阴离子表面活性剂、金属离子螯合剂、胶原蛋白水解酶以及甘油等。构建一个透明化颅窗大约只需15分钟，结合双光子显微镜，能够反复成像皮层浅层的树突棘、小胶质细胞和毛细血管[11]。

表1 颅窗手术方法比较

在神经科学研究中，钙信号是神经元—神经胶质细胞之间主要的信息传递者。研究表明[12]，为了捕捉到钙离子的快速变化，每帧图像的扫描时间应控制在200ms以内。钙闪烁的快速成像需在LSM Imaging面板切换到Resonant快扫模式，以Roundtrip方式进行扫描，调节Roundtrip扫描孔径使细胞胞体边缘实体化，将拍摄频率控制在33赫兹左右。由于最快扫描速度的限制，实验人员可以通过提高激光功率和检测器电压的比值的方法增强图像信噪比，实时监测神经元内的钙信号进行一段时间的记录。图像处理软件Cellsense能够对被记录图像中实时信号的变化进行分析，具体做法为以监测时间为横坐标，单个神经元荧光信号强度变化为纵坐标进行作图，形成的波形图中一个波峰即代表一个动作电位。

（三）双光子显微镜原位观察方法

众多脑部疾病在发展进程中，以脑组织局灶性缺血为核心，诱导生成一系列炎症因子，最终对神经元造成不可逆的损伤。因此，活体脑血管形态观察、血液流速分析是判断脑组织损伤程度的重要指标。实际研究过程通常要求测量同一视野下的数据进行术前与术后的比较，定位需精确到同一根血管或同一个神经元。然而，脑小血管是体内最复杂的血管网络系统，包含直径介于40～200μm的微小动脉、小动脉和小静脉，实验人员很难对活体对象的同一根微小血管进行原位观察和反复对比。双光子显微镜的高倍物镜和Map拼接功能能够拍摄全颅窗内的微小血管，再通过前后比较可以较好找到初始视野，无需特异性染色标记。这是一种简便的原位血管观察方法。

原位血管观察流程主要依据双光子软件的Map地图拼接功能，小鼠全颅窗的定义方法是利用Point Register工具沿着颅窗边缘划出轮廓，再圈选整个颅窗，进一步标记Num of Areas。与常规观察类似，检测通道和每个区域的荧光强度和焦平面都需设置正确以确保图像分辨率达到最佳。设置完成后，拍摄模式选择Resonant，添加8-10次平均降噪处理，软件完成所有操作后MATL中开始拍摄。拍摄完成得到的图像需在大图拼接模块进行Splicing拼接。小鼠经手术处理后，实验人员通过比对Areas的血管走向和形态找到相同视野，拍摄同一根血管图像。高分辨率的实验分析需要在Cellsense软件中进行消卷积处理，此操作可显著提高图像质量。

三、双光子显微镜管理思路

（一）双光子仪器校准与维护

温湿度是影响仪器系统稳定性的重要因素。仪器室的环境温度应恒定在18～22℃，湿度应维持在40%～60%。此外，外置NDD检测器具有极高的感光灵敏度，环境光会使其性能下降。因此，实验人员启动软件之前，需关闭室内灯，使显微镜主机周围区域保持在黑暗状态。为了确保输出稳定的激光束，IR脉冲激光器需要在每次实验之间预热至少30分钟，并由专业人员定期进行检测，检测内容包括以下：主激光器Insight X3和副激光器Mai Tai DeepSee的电流应分别稳定在10.3mA和6.51mA左右，湿度显示在10%以下，移动波长功率曲线。其中，X3激光器应在900nm达到最大功率，呈现为中间高，两边下降的平宽型正态分布样。当实际功率大于指标功率时，这说明激光器正常可用。Mai Tai激光器在800nm时功率最大，功率曲线应呈现为中间高，两边快速下降的陡窄型正态分布样。当DeepSee power/Mai Tai power＞85%时，这说明激光器正常可用。在激光器的日常维护中，我们要注意激光器电源及水冷系统需常年保持开启，定期检查除湿通气管和冷却液管是否畅通，及时更换冷凝液进行循环冷却，以维持飞秒激光器的恒定温度在21℃下才能工作。另外，实验人员要根据样本的观察需求，选择配备相应的物镜镜头，使用浸液系物镜时，将物镜顶端浸入有标本的介质中，避免超过电绝缘区，每次浸没使用后，需用中性洗涤剂清洗前端镜头。

（二）双光子仪器培训与开放使用

大型仪器设备是衡量各高校科研实力的重要指标之一，而一个健康的共享机制则是仪器平台可持续发展的关键条件之一。通过实施申请培训—考核—授权使用的流程，用户能够熟练掌握仪器的基础知识，并根据他们所具备的相应仪器操作能力的等级进行分类，进而开放不同的使用时段。这一做法不仅可以优化仪器的使用效率，而且能培养用户独立操作科研设备和创新实践的能力。目前，平台培训主要以集中培训为主，辅以定制化培训。双光子显微镜作为专人专管的仪器，其培训方案分为理论培训和上机培训两部分，均由仪器管理员负责开展。理论培训的内容涵盖了仪器的工作原理、结构、应用及预约使用流程。以FVMPE-RS型号为例，其重要部件包括SpectraPhysics双飞秒激光器系统、多光子扫描系统、无针孔反射荧光4通道NDD检测器和全电动物镜聚焦式显微镜主机。其特点表现在使用共振式扫描振镜可以实现高速观察，而使用Galvanometer扫描振镜则能实现高分辨成像，同时，根据物镜和激光波长的不同，可以自动进行扩束，以实现高效率的成像。配备的负色散补偿系统可以最大程度地降低对标本的损坏，从而在较低激光功率下观察样本。理论培训结束后进行上机培训，内容包括开关机、软件使用流程及实操训练。我们给用户培训时要演示正确的开关机顺序，强调按照标准流程开机，分为9步：1.打开电动显微镜BX63部件控制器；2.打开电动载物台控制器电源；3.打开汞灯电源；4.打开扫描系统控制部件FV30-PSU；5.打开同步光刺激组件FV30-SIMMP；6.打开双激光器引入装置；7.打开操控屏TPC；8.待TPC显示Start Operation后才能开启SW软件；9.在软件中打开激光。上述两部分培训经考核，成绩均合格后由仪器管理员在大仪预约系统上授权使用。

四、结束语

在体监测细胞功能、生物物质分泌过程和血管形态对于我们理解体内脏器病变的发展进程、揭示相关的病理机制并开展相应的治疗手段起着关键作用。活体光学成像是研究脏器组织结构和功能的一种重要方法。双光子显微技术常用于血管、淋巴、神经的精细结构成像，并在活体动物研究中具有特殊优势。在实验过程中，为了获得高分辨率的图像，我们需要注意以下几点：1.手术过程中，实验人员的动作要细致，时刻关注出血情况，避免污染观察窗口；2.透明化效果决定成像深度和图像信噪比。因此，在透明化试剂配制过程中，实验人员要确保澄清透明无沉淀，且应现配现用，透明时间需要充足，上机前要防止窗口产生气泡干扰。

双光子显微镜价格昂贵，维护复杂。因此，在日常使用的基础上，强化平台管理制度、制定系统化培训方案、建设多样化信息交流平台是维持仪器稳定状态、发挥大型科研仪器设备使用效益、加快科研成果产出的有利策略。本文介绍了超快速双光子在体显微成像系统的基本原理和组成，探讨了双光子显微镜在活体研究中检测方法的建立和观察要点，以及其创新管理模式，旨在为广大高校实验技术员提供借鉴思路。