卵母细胞与颗粒细胞的交互作用

黎 婷

(芜湖职业技术学院,安徽 芜湖 241000)

哺乳动物卵子发生起源于胚胎阶段,首先发育成为生殖祖细胞(primordial germ cells,PGCs),当PGCs迁移到胚胎性腺后发育成为卵原细胞,开始进行减数分裂成为卵母细胞,并停留在双线期,个别卵母细胞被单层扁平颗粒细胞包绕形成原始卵泡[1].之后当卵母细胞开始生长,单层扁平颗粒细胞变为立方形,并增殖形成多层次结构,被泡膜间质细胞包绕,从而形成次级卵泡,次级卵泡继续发育形成卵泡腔,成为有腔卵泡,而颗粒细胞分化形成卵丘颗粒细胞,围绕次级卵母细胞行成卵丘.雌性动物开始发情后,周期性分泌促性腺激素促进囊状卵泡中的卵母细胞完全成熟,继续完成减数分裂Ⅰ和减数分裂Ⅱ,继而排卵[2-3].

卵泡的发育受到下丘脑-脑垂体-卵巢轴中不同水平的激素调控,主要有下丘脑分泌促性腺素释放激素、垂体前叶分泌促卵泡素(follicle-stimulating hormone,FSH)促黄体素(luteinizing hormone,LH).卵巢产生雌激素[4].FSH刺激颗粒细胞增和颗粒细胞内的芳香化酶的活性,使雄激素转化为雌激素,增加雌激素的水平和促进子宫内膜的增殖,可用于诱发排卵或超排卵.初级卵泡到腔前卵泡中都表达FSH受体,受其促生长和抗凋亡作用形成有腔卵泡,FSH在卵泡发育中发挥主导作用[5].

在发现卵母细胞内源性生长因子之前,普遍认为卵母细胞的生长是受到单向调控,颗粒细胞提供营养成分,而FSH调控颗粒细胞的增殖[6].通过内分泌学和超微结构研究发现,位于卵母细胞和颗粒细胞之间的缝隙结合部存在物质转运,二者之间有丰富的物质联系,如颗粒细胞通过缝隙结合部提供小分子物质,如营养素、分子信号等调节卵母细胞发育和成熟,卵母细胞产生自源性生长因子GDF9和BMP15,卵泡发育受到卵母细胞和颗粒细胞的双向调控[7].

1977年,Eppig[8]使用卵母细胞体外培养体系首次进行系统性研究,利用未成熟卵母细胞体外培养获得成熟卵母细胞的新技术.近年来已有体外培养小鼠、牛等多种动物的胚胎干细胞和诱导多潜能干细胞,获得成熟卵母细胞的研究报道[9].该繁殖技术已被广泛应用于试管婴儿、遗传改良等人和动物的生殖研究,以期改善人类生活、产生更大的经济效益[10].

1 颗粒细胞对卵母细胞的作用

1.1 卵母细胞和颗粒细胞间的结构连接

原始卵泡外周被前颗粒细胞直接围绕,进入生长期后很快产生透明带包绕卵母细胞,将其与颗粒细胞隔开,而颗粒细胞会形成胞质突,穿过透明带,仍和卵母细胞维持一定的直接接触[11].大部分胞质突由富含肌动蛋白丝的主链构成,小部分由微管蛋白构成,因此颗粒细胞层中远层的颗粒细胞仍能保持和卵母细胞的直接联系[12].胞质突的数量和形状随着卵泡发育发生动态变化,促进卵母细胞生长,在体外培养中胞质突显著减少,添加雌二醇和FSH可缓解胞质突的减少,提高卵母细胞体外培养成熟率[13].

在胞质突的顶端,颗粒细胞与卵母细胞之间的缝隙结合部,形成胞间通道,允许离子和小分子物质(<1kDa)直接通过,缝隙结合部由连接蛋白类组成,6个连接蛋白寡聚体化形成1个连接子,相邻细胞间(卵母细胞和颗粒细胞间、卵泡的颗粒细胞间)的两个连接子组成通道,从而形成缝隙结合部[14].另外一些观点认为,颗粒细胞、卵泡(包括卵母细胞,不包括泡膜细胞,二者被基膜分离)形成功能性胞体,小分子物质如氨基酸、核酸、代谢产物和cAMP等都通过颗粒细胞的缝隙结合部,与卵母细胞进行物质交换,这对卵泡发育至关重要,如小鼠卵母细胞不能合成Cx37(Connexin37,细胞连接蛋白37),卵母细胞只能发育为正常体积的74%,不能完成减数分裂,卵泡也不能发育为成熟的格拉夫卵泡[15-16].

1.2 氨基酸类和能量底物

颗粒细胞可以通过缝隙结合部运送营养物质(如氨基酸类)和能量物质(能量底物)给卵母细胞,目前在小鼠生长卵母细胞中的6种氨基酸转运系统已被确定,颗粒细胞显著增强其中甘氨酸、丙氨酸、赖氨酸和牛磺酸的摄取量[17].小鼠、牛、羊和人等动物的卵母细胞可以通过葡萄糖转运系统摄取葡萄糖,但由于缺乏糖酵解酶中的果糖磷酸激酶,哺乳动物卵母细胞利用葡萄糖作为能量底物的能力很低[18].因此,大多数哺乳动物卵母细胞的能量底物来源于颗粒细胞将葡萄糖转化为卵母细胞可利用的物质,如丙酮酸盐、乳酸盐、NADPH等,以满足卵母细胞的生长需求,而不是直接利用葡萄糖.体外培养卵母细胞的生长速率与共培养的颗粒细胞数量呈显著正相关,如小鼠卵母细胞体外培养体系中没有颗粒细胞时,直径到35 μm即停止生长,正是因为颗粒细胞通过缝隙结合部进行的氨基酸类和能量底物转运,对卵母细胞的活力和生长有着至关重要的作用[19].

1.3 cAMP和cGMP

原始卵泡中卵母细胞生长期到减数分裂Ⅰ期即停滞,而卵泡在FSH和LH作用下继续成熟,原始卵泡、初级卵泡和次级卵泡,甚至早期有腔卵泡中的卵母细胞都没有继续进行减数分裂的能力[20].而在生长期最后由于促性腺激素的作用,卵母细胞以分段式完成减数分裂,到达减数分裂Ⅱ期[21].这种减数分裂的分段式完成受到卵泡环境和颗粒细胞的抑制作用,卵泡排卵后由于摆脱了卵泡环境和颗粒细胞的抑制,即使没有促性腺激素,卵母细胞可自发完成减数分裂[22].研究发现,卵母细胞自发完成减数分裂是胞内cAMP水平下降引起的.颗粒细胞通过缝隙结合部给卵母细胞运送cGMP,cGMP抑制磷酸二酯酶3(cAMP水解酶),从而维持卵母细胞胞内高cAMP水平阻断减数分裂,这些环核苷酸对卵母细胞的减数分裂起到负反馈调节作用[23].

cAMP和cGMP分别由腺苷酸环化酶和鸟苷酸环化酶合成,磷酸二酯酶类可降解cAMP和cGMP.研究发现,cAMP及卵泡液(主要是其中的次黄嘌呤)协作使小鼠卵母细胞无法停留在减数分裂Ⅰ期,次黄嘌呤抑制cAMP水解酶-磷酸二酯酶的活性[24].颗粒细胞中主要的鸟苷酸环化酶是钠尿肽受体2,是配体利钠肽的受体,使用利钠肽处理卵丘-卵母细胞复合体,可提高cGMP水平,敲除利钠肽或其受体基因的小鼠卵母细胞无法停留在减数分裂Ⅰ期,最终早熟早衰[25].

1.4 旁分泌因子

颗粒细胞分泌可分泌多种物质,调控卵母细胞的生长和成熟,颗粒细胞生成的雌激素类可刺激自身增殖,分泌的旁分泌生长因子可直接刺激卵母细胞的生长,生成的激活素和抑制素均属于转化生长因子β家族,发挥调控脑垂体分泌FSH的作用[26].目前研究最多的调控粒层-卵母细胞交互作用的配体受体系统是酪氨酸激酶及其受体,对卵母细胞和卵泡的所有发育阶段都起到促进作用,可能也与原始卵泡中休眠卵母细胞的唤醒有关[27-28].

2 卵母细胞与卵泡发育

2.1 卵源因子:GDF9和BMP15

实施显微操作卵子去除术会引起颗粒细胞的黄体化,说明一些卵源物质可能阻止颗粒细胞的自发黄体化,证实了卵源物质对颗粒细胞功能的直接影响,这些实验结论是基于排卵后颗粒细胞黄体化的生理学现象[29].卵母细胞对颗粒细胞的作用与卵源物质调控糖酵解和三羧酸循环有关,从而调控颗粒细胞的功能[30].研究发现卵母细胞生成的特异性生长因子调节卵泡发育,GDF9敲除小鼠的原始卵泡发育到形成1-2层颗粒细胞包绕即停止发育,而BMP15敲除母鼠生育力低下,免疫抑制GDF9和BMP5会显著减少有腔卵泡的数量,最终证实了两种卵源因子GDF9和BMP15的存在及对其颗粒细胞和卵泡发育的影响,GDF9和BMP15均属于转化生长因子β家族[31-32].

2.2 颗粒细胞的增殖和形态学研究

每个原始卵泡都包含一个卵母细胞及包绕在外的单层扁平颗粒细胞,当卵母细胞开始生长,颗粒细胞从扁平变为立方形,并随着卵泡的发育开始增殖.体内外实验显示,无腔卵泡中颗粒细胞的增殖受FSH和雌激素17β促进,无腔卵泡和有腔卵泡的颗粒细胞都受卵母细胞分泌的GDF9和BMP15促进,大量增殖从而形成卵丘[33].

实验发现,体内颗粒细胞与体外培养颗粒细胞的外形有所差异,体外颗粒细胞外形类似成纤维细胞,这种形态学的改变可能是由于FSH、cAMP类似物和生长因子的作用因引起的[34].近期研究发现,体外培养牛卵丘(去除卵母细胞)与颗粒细胞,单独添加BMP15与不添加GDF+BMP15的情况下,颗粒细胞都分化为类似成纤维细胞,而添加GDF+BMP15后外形变为菱形,与不添加GDF+BMP15体外培养的卵丘-卵母细胞复合体中的颗粒细胞形态相似,显示卵母细胞通过GDF9和BMP15维持颗粒细胞的外形[35].颗粒细胞具有高度分化潜能,在体外培养时可分化为多种细胞系,如成骨细胞、软骨细胞和神经细胞,卵源生长因子对于维持颗粒细胞的外形是必需的[36].

2.3 卵泡腔的形成

在卵泡发育后期,卵泡液开始积聚在颗粒细胞层之间形成的一个单独空间就是卵泡腔.卵泡腔是哺乳动物的特有结构,可能与哺乳动物卵生及卵巢中卵泡的选择性发育有关.无腔卵泡体外培养实验显示,添加FSH可刺激卵泡腔的形成;去除了卵母细胞的无腔卵泡无法形成卵泡腔,添加GDF9和BMP15会形成卵泡腔类似结构,证实卵母细胞可能通过GDF9和BMP15参与了卵泡腔的形成[37].

3 结 论

哺乳动物卵巢、卵母细胞生长和卵泡发育是一个协调发生的漫长过程,以期排卵后产生具有受孕能力的卵子.在这个过程中,停留在减数分裂Ⅰ期的卵母细胞随着颗粒细胞增殖、分化和有腔卵泡的发育重新开始减数分裂,同时在脑垂体作用下卵母细胞促进了卵泡的发育及颗粒细胞的增殖和分化.这种双向交互作用一通过卵源因子GDF9和BMP15调控颗粒细胞增殖、分化及颗粒细胞cAMP及cGMP合成量,二通过颗粒细胞经缝隙结合部运送cAMP及cGMP给卵母细胞调控卵母细胞生长发育及卵母细胞GDF9和BMP15的合成量得以实现.最终保证卵母细胞和卵泡生长发育的协调性,以及哺乳动物个体正常的卵巢功能,产生具有受孕能力的卵子.卵母细胞体外培养系统需要更成熟的条件才能完善卵母细胞的全部生长过程,对卵母细胞和颗粒细胞交互作用的研究是为了更好的改进体外培养系统,从而掌握这项生殖技术,更好的为人类服务.