miR-93-5p/FOXJ2轴介导胃癌细胞的生物学功能

沈蕾 钮渊杰 宋巍 陈二林

[摘   要]   目的：评估miR-93-5p对胃癌细胞的调节和功能。方法：采用qPCR检测miR-93-5p在胃癌组织、胃癌细胞系中表达，MTT、克隆形成、Transwell实验检测miR-93-5p对胃癌细胞增殖、侵袭的影响，双荧光素酶报告基因实验检测miR-93-5p与FOXJ2的靶向关系。结果：miR-93-5p在胃癌细胞系和胃癌组织中表达升高，抑制miR-93-5p表达后胃癌细胞增殖和侵袭能力受抑。双荧光素酶报告基因检测显示，miR-93-5p mimic显著降低MKN28和MKN45细胞Wt-FOXJ2相对荧光素酶活性，FOXJ2为胃癌细胞中miR-93-5p的直接靶基因。结论：miR-93-5p靶向FOXJ2促进胃癌细胞的增殖和侵袭，miR-93-5p/FOXJ2轴可能是判断胃癌预后的生物标志物和治疗靶点。

[关键词]  胃癌；miR-93-5p；肿瘤标志物；增殖和侵袭；生物学功能

[中图分类号]   R735.2 [文献标志码]   A [DOI]   10.19767/j.cnki.32-1412.2024.01.001

miR-93-5p/FOXJ2 axis mediates biological function of gastric cancer cells

SHEN Lei1， NIU Yuanjie2， SONG Wei2， CHEN Erlin3

（1Department of Laboratory Medicine; 3Department of General Surgery， Affiliated Hospital of Nantong University， Jiangsu 226001;

2Medical College of Nantong University）

[Abstract]   Objective： To evaluate the regulation and function of miR-93-5p on gastric cancer cells. Methods： qPCR was used to detect the expression of miR-93-5p in gastric cancer tissue and gastric cancer cell lines. MTT， clone formation and Transwell were used to test the effect of miR-93-5p on proliferation and invasion of gastric cancer cells. Double luciferase reporter gene experiment was performed to test the targeting relationship between miR-93-5p and FOXJ2. Results：The expression of miR-93-5p was upregulated in gastric cancer cell lines and tissues， and the proliferation and invasion ability of gastric cancer cells was inhibited after inhibiting miR-93-5p expression. Double luciferase reporter gene detection showed that miR-93-5p mimic obviously decreased the relative luciferase activity of Wt-FOXJ2 in MKN28 and MKN45 cells， and FOXJ2 was the direct target gene of miR-93-5p. Conclusion： miR-93-5p targets FOXJ2 to promote the proliferation and invasion of gastric cancer cells， and miR-93-5p/FOXJ2 axis may be a biomarker and therapeutic target for the prognosis of gastric cancer.

[Key words]   gastric cancer; miR-93-5p; tumor markers; proliferation and invasion; biological function

胃癌是常見的恶性肿瘤，是全球癌症相关死亡的主要原因之一[1]。尽管人们对胃癌的认识不断提高，但是其发生和发展的分子机制仍较模糊，鉴定胃癌相关生物标志物具有重要的临床意义。微小RNA（miRNA）对细胞增殖、迁移和侵袭具有显著调节作用，对不同肿瘤发挥致癌或抑癌作用。miRNA属于高度保守的非编码小RNA，主要通过与mRNA 3′UTR的直接作用抑制基因表达[2]。miRNA既可以作为致癌基因，也可作为抑制剂，通过靶向多种转录本参与细胞增殖、分化、凋亡等多种生物学过程，与肿瘤的发生发展有关[3]。有研究发现，在胃癌组织中miR-93-5p表达减少，并与HCP5/WNT5A负相关性[4]。然而，miR-93-5p影响胃癌发展的机制尚不清楚，本研究旨在评估miR-93-5p对胃癌细胞系的调节和功能。

1   材料与方法

1.1   组织标本和细胞培养   随机选取2021—2022年南通大学附属医院接受胃癌根治术患者35例，获取手术切除的癌组织及其配对癌旁组织标本。人胃癌细胞系MKN28、BGC-823、SGC-7901和MKN45以及正常细胞系GES-1购自中国科学院细胞库（上海）。BGC-823和SGC-7901细胞培养于含10%胎牛血清（FBS，Gibco）的RPMI-1640（Gibco，Carlsbad，CA，USA）培养基中，MKN28和MKN45细胞培养于含10%FBS的DMEM（Gibco）培养基中，置于37 °C、5%CO2培养箱中培养。本研究获得南通大学附属医院伦理委员会的批准。

1.2   蛋白质印迹分析   采用裂解液从胃癌组织和细胞中分离总蛋白质，测定蛋白质浓度。基于Bio-Rad 蛋白质测定系统（Bio-Rad，Hercules，CA，USA）鉴定蛋白质浓度。使用SDS聚丙烯酰胺凝胶电泳（SDS-PAGE）分离蛋白质，然后将其转移至PVDF膜（Millipore）。按照制造商的说明书，用适当的抗体对膜蛋白进行免疫印迹，使蛋白质条带可视化和量化。FOXJ2一抗（Santa Cruz）稀释比例为1 ∶ 1 000。N-cadherin一抗（Proteintech）稀释比例1 ∶ 5 000。Vimentinn一抗（Proteintech）稀释比例1 ∶ 3 000。β-actin一抗（Proteintech）稀释比例1 ∶ 10 000。二抗为兔来源（Proteintech），稀释比例1 ∶ 10 000。采用ECL显影。

1.3   实时定量PCR   采用TRIZOL试剂（Invitrogen）提取肿瘤组织和细胞中总RNA。使用cDNA Synthesis Kit（Takara， Tokyo，Japan）合成cDNA。miRNA和mRNA的qPCR按照制造商（Life Technologies，Carlsbad，CA，USA）说明书使用特定引物进行。miRNA和mRNA的qPCR的内参分别为U6或β-actin mRNA。引物序列：miR-93-5p：5′-GCCGCCAAAGTGCTGTTC-3′（Forward），5′-CAGAGCAGG-GTCCGAGGTA-3′（Reverse）；U6：5′-CTCGCTTCGG-GCAGCACA-3′（Forward），5′-AACGCTTCACGAAT-TTGCGT-3′（Reverse）。

1.4   荧光素酶报告基因实验   细胞以1×105个/孔的密度接种于24孔板中，转染前继续培养24 h。荧光素酶报告基因实验体系为0.5 μg pGL3-FOXJ2-3′UTR或pGL3-FOXJ2-3'UTR Mut质粒、0.05 ng pRL-TK对照载体（Promega，USA）和100 nmol/L miRNA，使用Lipofectamine 2000（Invitrogen，USA）进行转染。使用双荧光素酶报告基因检测试剂盒（Promega，USA）检测荧光素酶活性，通过海肾荧光素酶活性评估标准化。

1.5   细胞增殖和克隆形成实验   将3×103个细胞/孔接种在24孔板中，在完全培养基中培养。随后细胞用20 μL MTT（5 mg/mL）处理并培养4 h。弃去培养基后，将甲臜晶体重新悬浮在二甲基亚砜（DMSO）中，立即使用酶标仪在490 nm处检测吸光度。将1×103个细胞/孔接种在6孔培养板中，在完全培养基中培养。培养1天后，用甲醇固定，0.1%结晶紫染色，统计细胞集落个数。对至少50个细胞组成的集落个数进行评分。

1.6   Transwell实验   通过transwell室（BD Biosciences）测定细胞迁移和侵袭能力。转染后24 h收集转染细胞，将3×105个转染细胞或对照细胞培养于上室的无血清培养基中，将含10%FBS培养基500 μL添加到下室。培养2天后，用棉签从transwell膜表面擦弃未迁移和未侵入的细胞，甲醇固定残留在基质上的细胞，0.1%结晶紫染色，计算细胞个数。

1.7   统计学处理   应用SPSS 26.0统计学软件进行数据分析。计量资料以x±s表示，两组间比较采用t检验；单向方差分析用于评估不同组中变异的显著性。P<0.05为差异具有统计学意义。

2   结      果

2.1   miR-93-5p在胃癌中過表达   qPCR分析显示，与正常细胞系相比，4个胃癌细胞系BGC-823、SGC-7901、MKN28和MKN45中miR-93-5p表达水平均明显升高，差异均有统计学意义（P<0.05）（图1A）。加入miR-93-5p inhibitor后，MKN28和MKN45细胞中miR-93-5p表达显著降低，差异均有统计学意义（P<0.05）（图1B）。胃癌组织中miR-93-5p表达水平高于配对癌旁组织，差异有统计学意义（P<0.05）（图1C）。

2.2   miR-93-5p inhibitor抑制胃癌细胞增殖和侵袭   为了进一步探索miR-93-5p在胃癌发展中的作用，使用miR-93-5p inhibitor转染MKN28和MKN45细胞，在体外进行MTT实验、克隆形成实验和Transwell实验。MTT实验表明，miR-93-5p inhibitor抑制MKN28（第5天NC：5.6±0.4；miR-93-5 p inhibitor：2.7±0.2）和MKN45（NC：5.9±0.4；miR-93-5p inhibitor：2.8±0.3）细胞增殖（图2A）。克隆形成实验表明，miR-93-5p inhibitor抑制MKN28（NC：219±22.7；miR-93-5p inhibitor：86±9.3）和MKN45（NC：192±21.5；miR-93-5p inhibitor：89±7.2）细胞的克隆形成能力（图2B）。Transwell实验表明，miR-93-5p inhibitor抑制MKN28（NC：205±5.8；miR-93-5p inhibitor：41±5.6）和MKN45（NC：218±5.6；miR-93-5p inhibitor：89±2.51）细胞的侵袭能力（图2C）。

2.3   FOXJ2是miR-93-5p在胃癌细胞中的直接靶点   为了确认FOXJ2是否为miR-93-5p的靶点，推测miR-93-5p结合位点位于FOXJ2 mRNA的3′UTR中，将FOXJ2野生型（Wt-FOXJ2）或突变型（Mut-FOXJ2）3′UTR片段克隆到双荧光素酶报告基因载体中，随后共转染miR-93-5p mimic或miR-NC（阴性对照）进行双荧光素酶报告基因检测。结果显示，在MKN28和MKN45细胞中，miR-93-5p mimic均显著降低Wt-FOXJ2相对荧光素酶活性，差异有统计学意义（P<0.05），但Mut-FOXJ2荧光素酶活性与阴性对照组相比无显著变化（图3），表明FOXJ2与miR-93-5p之间存在靶向调控作用。

2.4   FOXJ2部分逆转miR-93-5p介导的胃癌进展   为了验证miR-93-5p是否通过靶向FOXJ2在胃癌进展中发挥生物学作用，用miR-93-5p inhibitor和FOXJ2干扰质粒共同转染MKN28和MKN45细胞。克隆形成实验显示，miR-93-5p inhibitor对MKN28（NC：201±19.8；miR-93-5p inhibitor：73±8.3；miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2：152±11.8）和MKN45（NC：208±14.3；miR-93-5p inhibitor：89±6.2；miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2：169±12.5）细胞增殖的抑制可以被si-FOXJ2逆转（图4A）。Transwell实验表明，miR-93-5p inhibitor对MKN28（NC：229±4.8；miR-93-5p inhibitor：47±5.3；miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2：187±5.2）和MKN45（NC：256±6.7；miR-93-5p inhibitor：52±3.1；miR-93-5p inhibitor+si-FOXJ2：192±4.2）细胞侵袭的抑制可以被si-FOXJ2逆转（图4B）。将miR-93-5p inhibitor转染到MKN28和MKN4细胞中，Western blot分析显示，miR-93-5p inhibitor显著促进FOXJ2表达蛋白质水平。此外，miR-93-5p inhibitor能抑制N-cadherin和Vimentin的表达，但这种抑制可被si-FOXJ2逆转（图4C）。

3   讨      论

由于缺乏早期有效诊断胃癌的生物标志物，多数患者确诊时已处于晚期，导致预后不良[5]。EMT是上皮细胞向间充质状态转化的过程，与癌症的侵袭和转移密切相关[6-8]。既往研究表明，miR-93-5p与胃癌进展密切相关，miR-93-5p过表达会导致胃癌患者发生远处转移和不良预后[7]。本研究发现miR-93-5p在胃癌组织中上调，miR-93-5p增加胃癌细胞增殖和集落形成能力。抑制miR-93-5p表达后可通过抑制N-cadherin和Vimentin的表达，从而抑制胃癌细胞EMT的信号通路。E-cadherin和Vimentin是EMT标记物，而EMT诱导物（Snail、Twist1和Prrx1）与癌症相关[9]。同时，据报道miR-93-5p也可以抑制MKL-1的表达，从而抑制乳腺癌细胞EMT[10]。提示失调的miR-93-5p作为致癌miRNA参与胃癌的进展。

据文献报道，miR-93-5p可通过Hippo信号通路失活促进胃癌的发展[11]。除胃癌外，miR-93-5p还可调控非小细胞肺癌（NSCLC）细胞的增殖和迁移。miR-93-5p表达上调与NSCLC预后不良相关[12]。此外，FOXJ2在胃癌细胞系中表达水平较低。本研究通过生物信息学工具预测miR-93-5p与FOXJ2之间的靶向关系，并通过双荧光素酶报告基因测定进行了验证。因此，miR-93-5p通过靶向FOXJ2促进肿瘤发生，应被视为新的治疗靶点。本研究发现，miR-93-5p通过下调FOXJ2表达激活EMT信号通路，从而促进胃癌细胞的增殖和侵袭。

据报道，与分化、凋亡、增殖、代谢、迁移和侵袭相关的基因受Forkhead box（FOX）转录因子家族的调节[13]。Forkhead box j2（FOXJ2）属于Forkhead box转录因子家族[14]，存在于多种哺乳动物和其他脊椎动物[15-16]，是一个新的Forkhead转录激活因子，能识别2种不同类型DNA序列，根据C-羧基末端的不同，分为FHX.L和FHX.S 2个亚型[15]。FOXJ2在胚胎发育早期开始表达，广泛分布在成年组织中[17]。研究表明，FOXJ2参与调节细胞周期进程，参与肿瘤发生[18]，调节细胞迁移和细胞周期[19-20]。WANG等[19]研究表明，FOXJ2通过调节E-Cadherin和波形蛋白降低肿瘤细胞的迁移能力，从而抑制乳腺癌转移。一些观察表明，升高的FOXJ2可抑制胶质瘤细胞的迁移和侵袭，并与E-Cadherin呈正相关[21]。此外，FOXJ2可能通过Notch信號通路促进非小细胞肺癌中EMT的发生[22]。我们发现miR-93-5p通过抑制FOXJ2促进胃癌细胞的增殖和侵袭，表明miR-93-5p与FOXJ2轴之间存在很强的相关性，对细胞增殖和肿瘤发生具有显著影响。

综上所述，miR-93-5p靶向FOXJ2促进胃癌细胞的增殖和侵袭，miR-93-5p/FOXJ2轴可能是判断胃癌预后的生物标志物和治疗靶点。

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[收稿日期] 2024-01-04

（本文編辑   王晓蕴）