基于生信分析探索FOSL1对肝癌索拉非尼治疗抵抗的影响

范绮雨 赵文静 刘继斌 刁迅 马娜 吴江熙 朱卫华

[摘   要]   目的：探究FOS樣抗原1（FOS-like antigen 1，FOSL1）在肝癌组织中的表达及其对索拉非尼治疗抵抗的影响。方法：从公共数据库中获取数据进行WGCNA分析，对获取的差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）进行GO功能富集和KEGG通路富集分析。选取血管生成通路差异表达基因，采用STRING数据库建立PPI网络，使用MCODE插件提取排名前7位的关键基因。在人类蛋白质图谱网站对这7个关键基因在肝癌血管内皮细胞表达情况进行筛选。采用Western blot法检测人微血管内皮细胞-1（human microvascular endothelial cells-1，HMEC-1）及肝癌血管内皮细胞（tumor-derived endothelial cells，TEC）中FOSL1的表达，CCK-8法检测HMEC-1及TEC细胞对索拉非尼敏感性，免疫组化检测肿瘤组织及正常肝组织中FOSL1表达。结果：GO功能富集分析图和KEGG通路富集分析图显示“索拉非尼抵抗”和“索拉非尼不抵抗”患者DEGs主要富集在管腔形成和血管生成等通路，KEGG通路主要富集在Wnt信号通路和VEGF信号通路。WGCNA分析得到关键模块，通过对关键模块基因筛选，最终得到JUND、JUNB、IL17RC、IL17RA、IL17F、IL1B、FOSL1 7个关键基因，其中FOSL1在血管生成中发挥重要作用。通过人类蛋白质图谱网站，发现FOSL1在肝脏各类细胞中表达，但在内皮细胞中表达较高。Western blot检测显示，FOSL1在TEC细胞中的表达水平明显高于HMEC-1细胞。免疫组化染色发现，肿瘤组织中FOSL1高表达，正常肝组织中FOSL1表达水平较低。CCK-8法检测显示，HMEC-1细胞对索拉非尼较敏感，而TEC细胞对索拉非尼不敏感。结论：FOSL1在肝癌血管内皮细胞中高表达，可能与促进血管内皮细胞增殖及索拉非尼治疗抵抗相关。

[关键词]   FOS样抗原1；肝癌；索拉非尼；生信分析；药物抵抗

[中图分类号]   R735.7 [文献标志码]   A [DOI]   10.19767/j.cnki.32-1412.2024.01.004

Exploring the effect of FOSL1 on sorafenib resistance

in liver cancer based on bioinformatics analysis

FAN Qiyu， ZHAO Wenjing， LIU Jibin， DIAO Xun， MA Na， WU Jiangxi， ZHU Weihua

（Affiliated Tumor Hospital of Nantong University/Nantong Tumor Hospital， Jiangsu 226361）

[Abstract]   Objective：To investigate the expression of FOS-like antigen 1（FOSL1） in liver cancer and the effect of FOSL1 on sorafenib resistance. Methods： Obtain data from public databases for WGCNA analysis， and perform GO functional enrichment and KEGG pathway enrichment analysis on the differentially expressed genes （DEGs） obtained. Select differentially expressed genes in the angiogenesis pathway， establish a PPI network using the STRING database， and extract the top 7 key genes using the MCODE plugin. Screen the expression of these 7 key genes in liver cancer endothelial cells on the Human Protein Atlas website. Western blot was used to detect the expression of FOSL1 in human microvascular endothelial cell-1 （HMEC-1） and tumor-derived endothelial cells （TEC）， CCK-8 method was used to detect the sensitivity of HMEC-1 and TEC cells to sorafenib， and immunohistochemistry was used to detect the expression of FOSL1 in tumor tissue and normal liver tissue. Results： GO functional enrichment analysis and KEGG pathway enrichment analysis showed that DEGs in patients with “sorafenib resistance” and “sorafenib non resistance” were mainly enriched in luminal formation and angiogenesis pathways， while KEGG pathway was mainly enriched in Wnt and VEGF signaling pathways. WGCNA analysis identified key modules， and ultimately identified JUND， JUNB， IL17RC， IL17RA， IL17F， IL1B， and FOSL1 7 key genes through screening of key module genes， among which FOSL1 played an important role in angiogenesis. It was found that FOSL1 was expressed in various liver cells through the Human Protein Atlas website， but more higher in endothelial cells. Western blot analysis showed that the expression level of FOSL1 in TEC cells was significantly higher than that in HMEC-1 cells. Immunohistochemical staining revealed high expression of FOSL1 in tumor tissue and low expression in normal liver tissue. CCK-8 assay showed that HMEC-1 cells were sensitive to sorafenib， while TEC cells were not sensitive to sorafenib. Conclusion： FOSL1 is highly expressed in liver cancer endothelial cells， which may be associated with promoting endothelial cell proliferation and sorafenib resistance.

[Key words]   FOS like antigen 1; liver cancer; sorafenib; bioinformatics analysis; drug resistance

肝细胞肝癌（hepatocellular carcinoma，HCC）是世界范围内高发的恶性肿瘤，据2020年流行病学统计，我国肝癌新发病例约占全球45.3%，位居全球第一，是严重影响国民健康的重大公共问题[1]。肝细胞肝癌多见于慢性肝病合并肝硬化患者，是一种以血供动脉化和血管异常为特征的高度血管化的实体瘤。肝癌中血管生成状态与疾病进展、预后密切相关，抗血管生成已成为有前景的新疗法。虽然抗血管内皮生长因子受体（vascular endothelial growth factor receptor，VEGFR）药物已在肝癌治疗中广泛运用，但对患者预后的改善仍有限，部分患者因产生治疗抵抗出现疾病反复复发、转移和病情恶化。索拉非尼（sorafenib）是一种靶向生长信号和血管生成的合成化合物，越来越多的学者认为肿瘤干细胞表型、上皮-间质转化（epithelial-mesenchymal transition，EMT）或对缺氧环境的适应等均可导致对索拉非尼的耐药，但具体机制不甚明确。因此，探索对索拉非尼耐药的机制对提高晚期肝癌患者的生存率具有重要意义。

FOS样抗原1（FOS-like antigen 1，FOSL1）是体内编码FOSL1蛋白的基因，又称为FOS相关抗原1（Fos-related antigen1，Fra-1），是位于染色体11q13原癌基因Fra-1的表达产物，与Jun家族表达产物构成异源二聚体AP-1，参与各种生长因子激活的信号级联，其中包括血管内皮生长因子[2]。本研究通过公共数据库获取肝细胞肝癌和索拉非尼相关数据，获取血管生成通路差异基因，提取出7个关键基因。采用Western blot检测人微血管内皮细胞-1（human microvascular endothelial cells-1，HMEC-1）及肝癌血管内皮细胞（tumor-derived endothelial cells，TEC）中FOSL1表达，免疫组化染色检测肝癌组织中FOSL1表达，CCK-8法检测HMEC-1细胞及TEC细胞对索拉非尼的敏感性，探究肝癌患者中FOSL1表达水平与抗血管生成治疗抵抗的关系。

1   资料与方法

1.1   公共数据库数据分析

1.1.1   数据获取：使用NCBI GEO（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/geo/）数据库，对关键词“HCC”和“sorafenib”进行检索。选取GSE109211数据集用于分析，GSE146409数据集用于验证。

1.1.2   数据处理及差异表达基因提取：GEO数据库为国际公共存储库，收录全球范围的微阵列芯片和高通量基因组数据。本研究从GEO数据库中下载基因表达谱数据集，采用R统计软件进行差异表达基因（differentially expressed genes，DEGs）分析，随后以|差异倍数（Fold Change）|≥2.0（P<0.01），错误发现率（false discovery rate，FDR）<0.01为标准进一步筛选差异基因。使用R软件ggplot2包和ComplexHeatmap分别绘制火山图和热图，显示显著调控的差异基因。

1.1.3   WGCNA构建共表达网络：加权基因共表达网络分析（weighted gene co-expression network analysis，WGCNA）将基因聚类到不同模块，揭示模块与疾病特征之间的关系。本研究使用R软件中的“WGCNA”程序包，以GSE109211为研究对象，以抵抗组和不抵抗组为临床特征，建立WGCNA共表达系统。为了将具有相似表达的基因归类为相同模块，本研究进行分级聚类，基因树图的最小数值（基因组）为50。为了进一步分析模块，对模块特征基因的差异性进行计算，为模块树图选择了一条切割线，并合并了一些模块。最终获得9个共表达模块，其中灰色模块是无法分配给任何模块的基因模块。

1.1.4   关键功能通路富集分析及HUB基因提取：对相关度较高的青色模块基因进行GO功能富集和KEGG通路富集分析，选取血管生成通路差异基因，采用STRING（https：//string-db.org）数据库建立PPI网络。将得到的基因导入Cytoscape软件中，使用MCODE插件提取排名前7位的关键基因进行分析。

1.1.5   关键基因进一步筛选及相关验证分析：在人类蛋白质图谱网站（https：//www.proteinatlas.org/）对这7个关键基因在肝癌血管内皮细胞表达情况进行筛选，并在TISCH数据库中选取肝癌数据集GSE146409进行单细胞分析验证关键基因。

1.2   实验方法

1.2.1   试剂：ECM培养基（美国Scien Cell公司），索拉非尼（美国Med Chem Express公司），FOSL1及Tubulin（美国Abcam公司），CCK-8细胞增殖分析试剂盒（中国碧云天公司），碱性修复液（中国Biosharp公司），免疫组化试剂盒（美国Sigma公司）。

1.2.2   细胞培养：HMEC-1细胞购自优宁维公司，TEC细胞提取自肝细胞癌微环境中的肿瘤微血管内皮细胞（专利号：ZL 201510684793.8），培养于含5%胎牛血清和双抗的ECM培养基中，置于37 ℃，5%CO2恒温细胞培养箱培养。

1.2.3   Western blot检测：采用RIPA裂解提取HMEC-1及FACS TEC细胞总蛋白，BCA测定蛋白浓度。制备上样缓冲液，电泳85 min后转膜，5%脱脂奶粉封闭120 min。1 ∶ 800稀释的兔源一抗（FOSL1、tubulin）孵育，4 ℃過夜。次日TBST洗膜3次后，二抗室温孵育1 h，TBST再洗膜3次，最后使用化学发光检测试剂显影。

1.2.4   CCK-8法检测细胞活力：HMEC-1和TEC细胞消化后，以3×103/mL密度接种至96孔板，待细胞贴壁后，弃去完全培养基，每孔加入200 μL基础培养基。次日加入不同浓度索拉非尼（0、0.1、0.5、2.5、12.5 μg/mL）继续培养48 h，每孔加入10 μL CCK-8试剂孵育2 h。经酶标仪测定各孔450 nm处光密度，计算细胞活力。

1.2.5   免疫组化：将脱蜡组织切片水化清洗后，置于修复液中加热，冷却至室温，再用阻断剂封闭20 min。清洗后每张片子滴加200 μL稀释的一抗（1 ∶ 400），置于4 ℃冰箱孵育过夜。第二天孵育二抗，进行DAB染色及苏木素染色，脱水，中性树脂封片。本研究所使用的肝癌组织及正常肝组织石蜡标本由南通大学附属肿瘤医院提供。

2 结  果

2.1   差异表达基因的鉴定与通路富集分析   原始数据归一化处理后，分为药物抵抗组和药物不抵抗组，进行limma分析，以|Fold Change|≥2.0（P<0.01）、FDR<0.01为标准鉴定出10 626个DEGs，共包括6 047个明显上调基因和4 579个明显下调基因（图1A）。图1B和图1C分别为差异基因的KEGG通路富集分析图和GO功能富集分析图，可见“索拉非尼抵抗”和“索拉非尼不抵抗”患者的DEGs主要富集在管腔形成和血管生成等通路上，KEGG通路主要富集在Wnt信号通路和VEGF信号通路上。

2.2   加权基因共表达网络分析   使用“WGCNA”包的“Pick Soft Threshold”功能过滤，将功率参数范围调整为1～30，使用功率b=12作为建立无标度网络的软阈值。我们将阈值设置为0.25和模块最小数量设置为50，再对集群中的类似模块进行合并，得到模块特征向量图，合并类似模块后共得到9个模块，这些模块各自包括表达特征相似的所有基因。随后进行样本及基因聚类。

为了进一步分析这些模块基因的特性，本研究对这些模块基因是否与药物抵抗的临床特征相关进行分析。如图2A所示，青色模块相关性较高，该模块包括1453个基因，此外，我们对该模块中的每个节点进行了基因与模块相关性（module membership，MM）及基因与性状相关性（gene significance，GS）分析，绘制相关性散点图，其相关系数为0.71。

2.3   关键基因筛选   将青色模块的DEGs分别进行KEGG和GO富集分析，如图2B所示，GO功能富集分析中排名靠前的包括脉管系统发育、血管发育及血管生成通路，随后提取这些通路的31个基因进行下一步筛选。为了明确这些差异基因之间的相互关系，将这些基因在STRING数据库中构建PPI网络，导出构建PPI网络后的基因，并导入Cytoscape软件（v3.9.1）中绘制PPI同心圆，然后通过MCODE插件进行subnetwork分析后得到结果。如图3A所示，中心7个红色三角形代表hub gene，包括JUND、JUNB、IL17RC、IL17RA、IL17F、IL1B、FOSL1。通过人类蛋白质图谱网站对这7个hub gene在肝癌内皮细胞中的表达进行比较，发现IL17RA、FOSL1、IL1B基因在肝癌内皮细胞中表达较高。图3B显示FOSL1在肝脏各类细胞中均有表达，但在内皮细胞中表达较高。

2.4   单细胞分析验证关键基因   在TISCH数据库中选取肝癌数据集GSE146409进行单细胞分析，并鉴定细胞类型。如图4A所示，将细胞分为10个集群，不同集群大致分为内皮细胞、上皮细胞、纤维母细胞、肝细胞等6种细胞。其中集群1为内皮细胞，集群2和5为上皮细胞，集群6为纤维母细胞。最后分析IL17RA、FOSL1、IL1B 3个hub gene在該数据集不同细胞中的表达水平，验证了转录因子FOSL1在肝癌内皮细胞中表达水平最高（图4B），表明FOSL1在肝细胞肝癌血管生成中具有重要作用。

2.5   FOSL1在TEC细胞中高表达且TEC细胞对药物不敏感   Western blot检测结果显示，TEC细胞中FOSL1表达水平明显高于HMEC-1细胞（图5A）。免疫组化染色显示，肝癌组织中FOSL1高表达，细胞核FOSL1抗体强染色，细胞质染色较浅，而正常肝组织中FOSL1表达水平较低（图5B）。CCK-8法检测结果显示，HMEC-1细胞对索拉非尼较敏感，而TEC细胞对索拉非尼不敏感（图5C）。

3   讨      论

肝癌是高度血管化的实体瘤，血管生成是肝细胞肝癌发生发展中的关键过程，新生血管可为肿瘤增殖、侵袭及转移提供必要物质条件。目前，抑制肝癌血管生成已成为治疗靶点，然而仍有部分患者因药物耐药导致治疗效果较差，因此，探究肝癌抗血管生成治疗耐药具有重要意义。

本研究选取索拉非尼耐药数据集进行分析，差异基因GO通路主要富集在血管生成及血管发育通路。为了进一步筛选关键基因，对DEGs进行WGCNA分析，得到关键模块，通过对关键模块基因的筛选，最终得到JUND、JUNB、IL17RC、IL17RA、IL17F、IL1B、FOSL1 7个关键基因，其中JUNB、JUND及FOSL1属于AP-1家族分子。有研究表明，AP-1转录因子参与调节血管内皮生长因子的表达和血管内皮细胞对血管内皮生长因子的反应[3-4]。通过控制JUNB在tip细胞中的时空诱导，可控制血管的伸长，表明JUNB是血管方向性的决定因素[5]。JUND可通过促进MAPRE2转录而导致食管鳞癌细胞增殖和血管生成[6]。EVELLIN等[7]发现内皮细胞中FOSL1可调控细胞表面关键分子的表达，从而调节内皮细胞的黏附及运动，在血管生成中发挥重要作用。有研究发现，小鼠FOSL1同源基因Fosl1是胚胎外组织血管形成所必需的，但FOSL1在血管生成中的作用机制尚不明确[8]。有研究表明，FOSL1在头颈部鳞状细胞癌中高表达，通过FOSL1-SE驱动的转录程序促进肿瘤转移，并促进上皮-间充质转化维持其干性[9]。缺乏核心调控回路关键成分FOSL1会减少骨肉瘤肿瘤的生长和转移，并且药物抑制CRC相分离导致转移抑制和对化疗药物的重新敏感[10]。

综上所述，FOSL1在肝癌血管内皮细胞中表达较高，可能与索拉非尼治疗抵抗相关，进而导致患者出现复发、转移等预后不良。

[参考文献]

[1] 陈建国，张永辉，陆建华，等. 中国肝癌预防与筛检工作实践及防控挑战［J］. 中国肿瘤，2023，32（11）：836-847.

[2] TALOTTA F，CASALINO L，VERDE P. The nuclear oncoprotein Fra-1：a transcription factor knocking on therapeutic applications door［J］. Oncogene，2020，39：4491-4506.

[3] SHIH S C，CLAFFEY K P. Role of AP-1 and HIF-1 transcription factors in TGF-beta activation of VEGF expression［J］. Growth Factors，2001，19（1）：19-34.

[4] WANG S，LU J W，YOU Q S，et al. The mTOR/AP-1/VEGF signaling pathway regulates vascular endothelial cell growth［J］. Oncotarget，2016，7（33）：53269-53276.

[5] YOSHITOMI Y，IKEDA T，SAITO-TAKATSUJI H，et al. Emerging role of AP-1 transcription factor JunB in angiogenesis and vascular development［J］. Int J Mol Sci，2021，22（6）：2804.

[6] ZHANG D，PAN G，CHENG N，et al. JUND facilitates proliferation and angiogenesis of esophageal squamous cell carcinoma cell via MAPRE2 up-regulation［J］. Tissue cell，2023，

81：102010.

[7] EVELLIN S，GALVAGNI F，ZIPPO A，et al. FOSL1 controls the assembly of endothelial cells into capillary tubes by direct repression of αv and β3 integrin transcription［J］. Mol cell biol，2013，33（6）：1198-1209.

[8] GALVAGNI F，ORLANDINI M，OLIVIERO S. Role of the AP-1 transcription factor FOSL1 in endothelial cells adhesion and migration［J］. Cell Adh Migr，2013，7（5）：408-411.

[9] ZHANG M，HOYLE R G，MA Z K，et al. FOSL1 promotes metastasis of head and neck squamous cell carcinoma through super-enhancer-driven transcription program［J］. Mol Ther，2021，29（8）：2583-2600.

[10] LU B，ZOU C Y，YANG M L，et al. Pharmacological inhibition of core regulatory circuitry liquid-liquid phase separation suppresses metastasis and chemoresistance in osteosarcoma［J］. Adv Sci，2021，8（20）：e2101895.

[收稿日期] 2024-01-20

（本文編辑   赵喜）