基于蛋白质组学探析针灸治疗哮喘的作用机制

方 芳,刘新颖,顾媛媛,蒙艳丽,郭玉岩△,左 军,龙 宇,郭媛琦

1.黑龙江中医药大学,黑龙江 哈尔滨 150040;2.黑龙江省中医药科学院,黑龙江 哈尔滨 150036

哮喘为一种常见的呼吸系统疾病,根据全球哮喘倡议(GINA)报告,许多国家的患病率有所增加,特别是在儿童中[1],哮喘以咳嗽、喘息、呼吸短促和胸闷为典型临床表现,并伴有呼气气流受限的症状[2],其发病严重影响人们的日常工作、学习和生活。吸入糖皮质激素(ICS)和支气管扩张剂是哮喘治疗的首选一线治疗方法,可以控制哮喘症状、提高患者生活质量和改善肺功能,降低发病率和死亡率[3]。而长期使用ICS有明显的副作用,据统计,在服用ICS的患者中,约有5%～10%的患者仍有呼吸困难的症状,并面临严重哮喘恶化的风险[4-5]。除了一线疗法外,一些补充和替代疗法被证明具有明显的优势,针灸是临床上治疗哮喘的常用方法。然而,针灸治疗哮喘的调控机制尚未完全阐明,本研究旨在基于蛋白质组学探析针灸治疗哮喘的作用机制,为哮喘的治疗提供新的思路和方法。

1 哮喘的发病机制研究

哮喘的发病机制复杂,目前尚无统一认识,普遍认为哮喘发病机制与气道慢性炎性症状、气道高反应性、气道重塑、遗传机制及机体免疫平衡遭到破坏有关,可由一种或多种因素共同作用。从气道炎症、气道高反应性和气道重塑3方面讨论哮喘的发病机制如下。

1.1 气道炎症

气道炎症是哮喘发病的核心环节,哮喘的炎症反应是由多种炎症细胞、炎症介质和细胞因子参与并相互作用的结果,钙结合在哮喘早期炎症发生的过程中起核心作用[6],抗原通过抗原递呈细胞激活T细胞,活化的辅助性T细胞(主要是Th2细胞)产生白细胞介素(IL)-4、IL-5及IL-13等进一步激活B淋巴细胞,后者合成特异性免疫球蛋白E(IgE),并结合肥大细胞和嗜碱性粒细胞(EOS)等细胞表面的IgE受体。由EOS、中心粒细胞、肥大细胞和T淋巴细胞等共同参与[2]。炎症细胞合成和释放多种炎性介质及细胞因子,造成气道炎症,导致哮喘发作。

1.2 气道高反应性

气道高反应性(AHR)是因气道炎症而贯穿哮喘全过程的气道病理状态。AHR反映由于一系列直接或间接刺激引起的气道平滑肌(ASM)收缩增加或功能障碍。有研究表明,T细胞的生理活动是哮喘AHR和炎症预后的关键因素[7]。T淋巴细胞亚群的变化中,以Th1/Th2和Th17/Treg平衡最为重要,Th2型细胞因子IL-13是哮喘发病的关键因子,通过促进黏液分泌和加重气道高反应性而引发哮喘,而Th1的细胞因子IL-12能下调Th2型细胞因子,降低气道高反应性,通过增强Th1细胞抑制Th2细胞分化促进Th1/Th2平衡的恢复[3],有助于哮喘的防治,Treg/Th17失衡也可能导致哮喘患者气道高反应性,针刺可以缓解这种失衡,CD4+T细胞亚群的平衡参与了针灸治疗哮喘气道高反应性的治疗过程[8]。

1.3 气道重塑

气道重塑是哮喘的主要病理特征,气道重塑包括呼吸道的各种结构变化如上皮变化、粘液腺增生、上皮下胶原层增厚、粘膜下基质沉积增加、ASM肥大和增生以及ASM束中肥大细胞[2]。气道重塑的最显著特征之一是气道平滑肌增厚,且无论是成年人还是儿童,平滑肌质量的变化都与哮喘的严重程度有关[4]。Rho/ rhokinase介导的信号通路在哮喘气道平滑肌收缩、气道重塑和气道炎症过程中起重要作用。TGF-β1被认为是气道重塑的主要中介[9],整个哮喘病程中均有TGF-β1的分泌,且易导致皮层纤维化,哮喘急性发作期能促使气道平滑肌细胞向上皮层移动,形成新的平滑肌束。Smads蛋白是TGF-β家族的特异性细胞内信号转导分子,TGF-β1/Smads信号传导通路可能通过调控平滑肌肌动蛋白(α-SMA)诱导成纤维细胞分化为肌成纤维细胞,导致哮喘气道重塑。刘慧慧等[10]发现针刺“肺俞”“定喘”“孔最”“鱼际”均可下调哮喘大鼠高表达的TGF-β1、Smad3 mRNA蛋白水平,减轻气道重塑。既往研究表明,平滑肌细胞可促进哮喘纤维增殖性气道重塑,TGF-β1是关键诱导信号,TGF-β在哮喘气道重塑的结构改变中起着重要作用[8]。

2 针灸治疗哮喘

2.1 针灸治疗哮喘的特点

针灸是中医的组成部分,用于治疗包括哮喘在内的多种疾病。现代医学研究发现针灸疗法主要通过对神经-免疫-内分泌网络的调节发挥治疗作用,针灸作为一种非特异性的物理刺激,对疾病的影响是通过激发体内固有的调节系统而实现的,通过人体经络系统发挥整体调节和双向调节等特点。

2.2 针灸治疗哮喘的优势

以针刺、灸法等疗法为代表的针灸疗法,是在中医整体观念以及辨证论治的指导下,通过调整人体脏腑气血阴阳,达到改善肺功能、缓解临床症状的功效。针灸疗法被广泛应用于哮喘等异质复杂疾病的治疗,对比西医西药具有价格低廉的优势。同时,针灸具有疗效良好、安全性高和无副作用等优势。近年来相关临床研究逐渐增多,证实了针灸疗法具有改善肺功能、调节人体免疫、改善哮喘症状以及提高活动耐量的作用,受到越来越多患者的接受和认可,大量临床报道证明针灸治疗哮喘有效。徐宁等[11]选取邵经明教授总结的治疗哮喘的经验穴“肺俞”“大椎”“风门”进行研究,发现针灸此3个穴位能明显降低哮喘模型大鼠血清中IL-13及肺组织中STAT6的阳性表达,证实针灸可以缓解气道炎症,降低气道高反应性,改善气道重塑,从而改善哮喘。李巍等[12]将92例哮喘患者随机分为治疗组(46例)和对照组(46例),治疗组采用电针肺俞穴,对照组口服舒氟美治疗,结果显示电针肺俞穴能显著提高PEF、FEV1、FVC及FEV1%水平,改善哮喘的喘息、气短和咳嗽等症状,使患者生活质量明显提高,表明针灸是治疗哮喘的一种有效治疗方法。

3 蛋白质组学在针灸治疗哮喘机制研究中的应用

蛋白质组学技术是从整体的角度分析细胞内动态变化的蛋白质的组成与活动规律,旨在了解这些蛋白质在不同环境和条件下的行为,与中医的“整体观念”不谋而合。蛋白质组学技术是揭示生命过程或疾病状态差异表达蛋白质,预测药物治疗靶点和作用机制的精确方法;是后基因组时代迅速发展的先进组学技术,主要研究某一细胞、组织或生物体在特定阶段或生理状态下蛋白质组成及变化规律,是筛选疾病早期诊断标志物与药物治疗靶点的重要技术手段。

3.1 蛋白质组学与气道炎症

钙结合在哮喘早期炎症发生的过程中起核心作用,S100蛋白包含两个EF-hand钙结合基序,与炎症密切相关,其中S100A8和S100A9两种钙结合蛋白在中性粒细胞和单核细胞溶胶中高度表达[13],诱导多种促炎分子的表达,激活p38或p44/42 MAP激酶和NF-κB等信号通路[6],有实验证明抑制S100A8和S100A9可减少向肺部迁移的炎症细胞[14]。CC10蛋白是一种激素诱导的、进化保守的分泌蛋白,属于分泌红蛋白家族[15],CC10基因表达降低的大鼠在哮喘发作时,S100A8和S100A9水平也会升高,并伴有免疫球蛋白中的RAGE蛋白水平升高,针灸治疗哮喘可能通过抑制这些炎症相关蛋白发挥作用[16]。蛋白质磷酸化是蛋白质翻译后修饰的重要内容,金属硫蛋白-2(MT-2)是一种高金属离子含量的人类低分子量蛋白,对外界因素敏感,可被激素、细胞因子和氧化剂等高度诱导[17-18],MT-2缺失的小鼠肺中IL-1β和支气管肺泡灌洗液中嗜酸性粒细胞水平显著升高,抗卵清蛋白抗体水平明显高于对照组,提示MT-2水平升高可能有助于哮喘的缓解,MT-2与针灸改善哮喘肺功能相关,特异性上调MT-2mRNA表达,MT-2可松弛气道平滑肌并诱导一系列蛋白质磷酸化,在针灸治疗哮喘中起重要作用[16]。

3.2 蛋白质组学与气道重塑

气道重塑是哮喘难治的关键因素,气道重塑的主要表现是气道平滑肌肥大增生,平滑肌细胞促进哮喘纤维增殖性气道重塑,Akt1是介导MT-2作用的最重要的枢纽蛋白之一,参与哮喘气道平滑肌的重塑。Akt1磷酸化与气道平滑肌收缩松弛密切相关,质粒转导或慢病毒感染导致Akt1过表达,可导致气道平滑肌细胞增大,蛋白质含量增加,提示Akt1激活可促进哮喘气道平滑肌肥大[18-19]。MT-2通过增加Akt1在Thr450位点的磷酸化来显著放松气道平滑肌细胞,改善气道重塑的情况。CaMK2β是另一个可被MT-2诱导的重要蛋白,CaMK2是一种多功能激酶,控制细胞的细胞形态、迁移等,CaMK2β作为CaMK2家族的重要成员,参与肌动蛋白的组装和结构调控,可增强肌球蛋白RLC磷酸化,从而收缩平滑肌,改善气道重塑,另外,研究发现CaMK2β和Akt1之间存在相关性[19-20]。针灸可以显著改善哮喘大鼠模型中的肺阻力,Akt1和CaMK2β等蛋白的相关磷酸化变化可能在针灸治疗哮喘的疗效中发挥重要作用[18]。

3.3 蛋白组学与气道高反应性

气道高反应性是由于一系列直接或间接刺激引起的气道平滑肌收缩增加或功能障碍。有研究表明,AKT是一种丝氨酸/苏氨酸特异性蛋白激酶,能通过活化一系列不同的下游信号分子来调节细胞生长、凋亡。徐慧等[21]研究发现,哮喘大鼠磷酸化AKT的表达明显升高,IL-12含量明显降低,磷酸化AKT蛋白通过上调IL-13、下调IL-12等细胞因子影响Th1/Th2的平衡,表明PI3K/AKT信号通路通过影响Th1/Th2炎性反应因子参与了AHR的过程,T细胞的生理活动是哮喘AHR和炎症预后的关键因素,因为其在免疫病理学和过敏原性之间建立了平衡[7]。胞内磷脂酰肌醇激酶(PI3K)能参与哮喘相关T细胞的发育、活化、增殖及分化,抑制PI3K信号通路可以增强转录因子Foxp3的表达,还能使转录因子RORγt的表达下降,RORγt/Foxp3的表达优势发生逆转,从而实现对哮喘Th17/Treg失衡的调控[22]。针灸治疗后Th17细胞的减少能减弱Treg的中和,在T淋巴细胞亚群的变化中,以Th1/Th2和Th17/Treg平衡最为重要,针灸能显著抑制哮喘大鼠肺组织中STAT3蛋白的表达、促进FOXP3蛋白的表达,从而调节Th17/Treg免疫失衡状态[23-24]。

4 小结

综上所述,针灸作为对哮喘的治疗具有显著的临床疗效,但其作用机制尚未明确,通过运用蛋白质组学技术,全面揭示哮喘在蛋白水平的变化趋势,找出潜在的诊断标志物,预测药物治疗靶点及作用机制,找出针灸的主要作用途径,为针灸作用的深入研究奠定基础。因此,基于蛋白质组学的针灸治疗哮喘机制研究将为针灸治疗哮喘提供重要科学依据。