橡胶树HbPIP2;3的亚细胞定位与多聚化分析

邹智 乔雪莹 郑玉皎 阳江华

关键词：乳管；水通道蛋白；亚细胞定位；双分子荧光互补；酵母双杂交

质膜内在蛋白（plasma membrane intrinsic protein，PIP）是一类原始而高度保守的水通道蛋白（aquaporin，AQP）[1]。根据进化关系和序列特征，PIP 可分为PIP1 和PIP2 两个亚类，前者具有较长的N 端，而后者具有较长的C 端[2-7]。在蟾蜍卵母细胞中的体外分析显示，PIP2 具有高效的水分转运活性，而PIP1 无活性或活性极低，究其原因主要是因PIP1 不能有效定位到细胞膜所致[8-14]。在玉米原生质中亚细胞定位分析显示，隶属于PIP2 亚类的ZmPIP2;1 和ZmPIP2;5 定位在细胞膜，而属PIP1 亚类的ZmPIP1;1、ZmPIP1;2 和ZmPIP1;6 均定位在内质网[9]。虽然PIP 单体本身就具有水分转运活性，但其在生物膜上以四聚体的形式起作用[15]。PIP 不仅可形成同源四聚体，同时也可以形成异源四聚体[15-18]。

橡胶树（Hevea brasiliensis Muell. Arg.）隶属于大戟科，是天然橡胶的主要商业来源[19-21]。生产上，橡胶通过用胶刀周期性地切割树皮收集胶乳而获得。胶乳系乳管细胞的胞质成分，水分含量60%～70%，水分通过调节胶乳的粘稠度和乳管膨压进而影响橡胶树的产排胶能力，是决定胶乳产量的关键因素[4， 11， 14， 22]。通过前期研究，本团队鉴定到1 个在乳管中高丰度表达的AQP 基因，即HbPIP2;3，发现该基因的表达水平与品系的胶乳产量和水分含量呈正相关，且该基因在蟾蜍中过表达可显著提高卵母细胞的水分透性[4， 14]。为揭示HbPIP2;3 调控乳管水分平衡的分子机制，本研究在前期工作基础上对其编码蛋白的亚细胞定位和多聚化特征进行分析，以增进对乳管水分平衡的分子认知，并为利用生物技术手段提高胶乳产量提供理论依据。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 植物材料 基因克隆所用橡胶树品系为热研7-33-97；亚细胞定位和双分子荧光互补（BiFC）所用材料为本氏烟草。

1.1.2 菌株及载体 大肠杆菌DH5α、根癌农杆菌GV3101、pNC-Cam1304-SubN、pNC-BiFC-ENN和pNC-BiFC-ECN 由本实验室保存；Y2HGold 购自天根生化科技（北京）有限公司；酵母双杂交载体购自宝日医生物技术（大连）有限公司。

1.1.3 主要试剂 各类酶、试剂盒及生化试剂详见文献[23-24]。

1.2 方法

1.2.1 RNA 提取和反转录 胶乳总RNA 的提取及cDNA 第一链的合成参照文献[4]。

1.2.2 基因克隆与载体构建 根据本地热研7-33-97 的基因组序列设计引物（表1），并以胶乳来源的cDNA 作为模板进行PCR 扩增。参照文献[24]，利用同源重组法将HbPIP2;3 构建到pNC-Cam1304-SubN、pNC-BiFC-ENN、pNC-BiFCECN、pGADT7 和pGBKT7。

1.2.3 生物信息学分析 蛋白的理化特性、保守结构域、亚细胞定位和二级结构预测分别采用Protparam（https：//web.expasy.org/protparam/）、CDD（https：//www.ncbi.nlm.nih.gov/cdd）、WoLF PSORT（https：//www.genscript.com/wolf-psort.html）和SOPMA（https：//npsa-prabi.ibcp.fr/cgi-bin/npsa_automat.pl？page=/NPSA/npsa_sopma.html）等在線工具分析。根据与菠菜SoPIP2;1[15]进行序列比对界定相应的跨膜螺旋区，并利用其晶体结构作为模板通过SWISS-MODEL（https：//swissmodel.expasy.org/interactive）在线软件进行3D 建模。

1.2.4 亚细胞定位和双分子荧光互补 含重组质粒农杆菌浸染液的制备及烟草叶片的瞬时转化参照文献[24]，其中，烟草幼苗约为5 周龄，转化48 h 后用共聚焦显微镜进行荧光观察。

1.2.5 酵母双杂交 诱饵载体pGBKT7-HbPIP2;3的自激活检测及点对点的酵母双杂交参照宝日医酵母双杂交试剂盒说明书。

2 结果与分析

2.1 基因克隆与载体构建

以HbPIP2;3F/R 为引物的首轮PCR 成功扩增到1 条约860 bp 的目的条带。随后，以第一轮PCR产物作为模板，分别以pCam1304-HbPIP2;3F/R、pNC-BiFC-HbPIP2;3F/R、pGADT7-HbPIP2;3F/R或pGBKT7-HbPIP2;3F/R 为引物进行第二轮PCR扩增，目的条带切胶回收后分别构建pCam1304-HbPIP2;3、pNC-BiFC-ECN-HbPIP2;3、pNC-BiFCENN-HbPIP2;3、pGADT7-HbPIP2;3 和pGBKT7-HbPIP2;3 等载体。

2.2 序列的生物信息学分析

测序及序列分析表明，HbPIP2;3 的CDS 全长为861 bp，预测编码286 个氨基酸，理论分子量为30.58 kDa，等电点为8.50，脂肪族指数为100.38，总平均疏水指数为0.449，不稳定系数为31.68。CDD 分析显示，该蛋白含有1 个高度保守的MIP 结构域，即32～267 位，共包含236 个残基（图1A）。序列比对显示，HbPIP2;3 与HbPIP1;1、SoPIP2;1 的序列相似性分别为72.1%和85.1%，拥有6 个典型的跨膜螺旋（即TM1～6）和2 个半螺旋（即HB 和HE），其中，位于2 个半螺旋上的NPA 基序，以及位于TM2、TM5 和LE 上的ar/R 选择性滤器完全一致，均为F-H-T-R；在5个Froger 位点（即P1～5）中，仅P1 存在变异，分别为Q-S-A-F-W、E-S-A-F-W 和M-S-A-F-W；此外，对应于SoPIP2;1 S115 的磷酸化位点和L197门控位点也完全一致，而对应于SoPIP2;1 S274 的磷酸化位点则只存在HbPIP2;3 和SoPIP2;1 中（图1B）。SOPMA 分析显示，HbPIP2;3 的α-螺旋占36.36%，延伸链结构占17.48%，β-转角占3.50%，无规则卷曲占42.66%；同源建模进一步证实该蛋白含有6 个跨膜螺旋，同时也显示其可以形成同源四聚体（ 图1C）。亚细胞定位预测显示，HbPIP2;3 定位在细胞膜。

2.3 亚细胞定位分析

以空载pNC-Cam1304-SubN 为对照，将含pCam1304-HbPIP2;3 的农杆菌工程菌微量注射烟草叶片后进行荧光观察，结果如图2 所示，转空载的荧光信号散布于细胞的各个区域，包括细胞核，而实验组仅见于细胞膜，这表明HbPIP2;3 定位在细胞膜。

2.4 BiFC 分析

以转pCam1304-HbPIP2;3 的为阳性对照、单转pNC-BiFC-ENN-HbPIP2;3 或pNC-BiFC-ECNHbPIP2;3 的为阴性对照，将分别含有pNC-BiFCENN-HbPIP2;3 和pNC-BiFC-ECN-HbPIP2;3 的农杆菌工程菌等量混合后转化烟草，荧光观察结果如图3 所示，2 个阴性对照均为未见信号，而实验组和阳性对照在细胞膜均发现强烈的荧光信号，这表明HbPIP2;3 可在细胞膜上形成多聚体。

2.5 酵母双杂交实验

自激活检测显示（图4），转pGADT7/pGBKT-7-HbPIP2;3 的阳性对照在二缺（SD-TL）、三缺（SD-TLH）和四缺（SD-TLHA）营养平板上生长旺盛，而实验组与阴性对照类似，在四缺板上均无生长，这表明pGBKT7-HbPIP2;3 无自激活活性。进一步的酵母双杂交实验显示（图5），实验组和阳性对照类似，在四缺板上生长旺盛，而阴性对照无生长，这表明HbPIP2;3 在体外也可形成多聚体。

3 讨论

作为天然橡胶合成和贮藏的场所，橡胶树乳管是一类高度分化的单一细胞类型组织[19]。与成熟叶片等组织不同，乳管无中央大液泡，取而代之的是成百上千的分散性小液泡，即所谓的黄色体[4， 19]。在成熟叶片中，水分的平衡由PIP 和液泡定位的液泡內在蛋白（tonoplast intrinsic protein，TIP）共同决定，而乳管的水分平衡则主要由PIP决定[7]，因此，分离和鉴定乳管表达的PIP 具有重要理论意义和应用价值[4， 11-14]。在3 个乳管高丰度表达的PIP 中，HbPIP1;4 和HbPIP2;7 在蟾蜍卵母细胞中异源表达均无水分转运活性[13]，而HbPIP2;3 的活性与HbPIP2;1 相当[11， 14]。由于HbPIP2;1 在乳管中的表达丰度很低， 因此，HbPIP2;3 被认为是调控乳管水分平衡的关键基因[4， 14]。

本研究结果显示，HbPIP2;3 含有一个AQP 家族特有的MIP 结构域（Pfam 登录号为PF00230），其中包含6 个典型的跨膜螺旋和2 个半螺旋，等电点>7.0，总平均疏水指数>0，不稳定系数为<40，属于稳定的疏水型碱性蛋白。与隶属于PIP1 亚类的HbPIP1;1 相比，HbPIP2;3 与SoPIP2;1 的序列相似性更高，具有较短的N 端和较长的C 端，且C 端含有1 个PIP2 亚类特有的磷酸化位点[15]。与生物信息学预测结果一致，在烟草叶片中的亚细胞定位分析显示HbPIP2;3 定位在细胞膜。与基于同源建模的3D 结构预测一致，BiFC 和点对点的酵母双杂交实验均表明HbPIP2;3 可形成同源四聚体。HbPIP1;1 虽然在烟草中也定位在细胞膜[24]，但与HbPIP2;3 和SoPIP2;1 不同的是，其在蟾蜍中并无水分转运活性[12]。虽然本研究试图通过序列比较寻求答案，但HbPIP1;1 具有HbPIP2;3 和SoPIP2;1 类似的ar/R 选择性滤器（F-H-T-R）以及典型的NPA 基序，理论上HbPIP1;1 应具有高效的水分转运活性，因此，相关的决定因子还有待进一步研究。另外一种可能是，HbPIP1;1 自身原本不能定位到细胞膜，但可以跟烟草中的PIP2蛋白互作进而有效定位。事实上，PIP1 和PIP2之间的异源互作广泛存在于不同植物中，如玉米、拟南芥、烟草、葡萄、甜菜、草莓、棉花、大麦，甚至还包括卷柏[8-9， 16-18， 25-27]。因此，进一步筛选和鉴定与HbPIP1;1 互作的PIP2 蛋白有助于阐明复杂的调控机制。

综上，本研究证实HbPIP2;3 在细胞膜上可通过同源四聚体的方式调控橡胶树乳管的水分平衡，但是否存在异源互作模式还有待进一步研究。