不同基因型可可发酵过程中挥发性香气成分变化规律研究

岳一轮 秦晓威 李付鹏 钟壹鸣 贺书珍 白亭玉 初众

关键词：可可；基因型；发酵；香气成分；顶空固相微萃取

可可（ Theobroma cacao L. ） 为梧桐科（Sterculiaceae）可可属（Theobroma）多年生热带经济作物[1]。可可豆富含脂肪、可可碱、多酚等活性成分，具有改善心脏、肾脏、肠道功能，缓解心绞痛等作用，是制作高级饮品、巧克力、糖果等的主要原料[2]。据联合国粮农组织（FAO）统计，2022 年世界可可收获面积达1.2×107 hm2，产量达5.8×106 t[3]，我国自20 世纪20 年代由东南亚引进试种成功，已发展成为热带特色高效农业的重要组成部分。据国际可可组织（ICCO）统计表明，2022 年国际优质可可出口占可可出口总量的12%，优质可可原料的供需矛盾极为突出[4]。因此，优质可可品种选育是国际可可提质增效的核心科学问题。

可可豆挥发性香气物质数量和种类是形成可可独特风味的重要因素，也是评价可可品质的重要指标[5]。相关研究表明，可可鲜豆挥发性物质成分与含量受可可基因型的影响[6]。QIN 等[7]利用HS-SPME-GC/MS 技术对国际可可三大遗传类型Criollo、Forastero 和Trinitario 的挥发性成分进行鉴定表明，可可鲜豆香气物质成分的组成和含量与可可的遗传背景存在一定关联。发酵是形成可可风味物质的关键步骤，会影响可可主要香气物质的形成[8]。房一明等[9]研究表明，发酵影响可可豆前体风味物质的形成。可可在发酵过程中产生具有花香和果香特征的挥发性物质，如芳樟醇（linalool）、苯乙醇（benzene ethanol）、乙酸戊醇（pentanol acetate）、丁醛（butanal）等香气物质[10]。此外，段美玉等[11]、RAHARDJO 等[12]通过45 ℃和50 ℃的控温发酵试验研究了发酵过程对可可香气的影响，研究表明控温条件下可可发酵时间与香气物质成分之间存在显著相关性。

目前，关于不同基因型可可发酵过程中主要挥发性香气成分的变化规律及其差异性研究鲜见报道，且主要香气成分与可可豆发酵阶段的相关性还有待证实。顶空固相微萃取-气质联用法（SPME-GC/MS）因其方便快捷、灵敏度高、选择性与重复性好，能较真实地反映待测物中挥发性物质的基本组成等优点而广泛应用于发酵食品挥发性香气成分的分析[13]。HEGMANN 等[14]采用SPME-GC/MS 方法分析表明，旱季和雨季可可豆果肉之間的香气成分存在显著差异。谷风林等[15]利用SPME-GC/MS 技术揭示了可可发酵过程中蛋白质降解与吡嗪类化合物的变化规律。为揭示不同基因型可可发酵过程中挥发性香气成分的变化规律与组成差异，本研究以我国筛选的3 份优质可可种质资源为研究对象，采用HS-SPMEGC-MS 技术对不同发酵阶段可可的挥发性香气成分进行鉴定，分析不同基因型可可发酵过程中挥发性香气成分的组成及差异，以期为优质可可新品种选育提供数据支撑及科学依据。

1 材料与方法

1.1 材料

试验材料：选用中国热带农业科学院香料饮料研究所国家热带植物种质资源库香料饮料种质资源分库（NTPGRC2021-014， 2022-014）保存的ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 三份不同基因型可可资源（图1）。

仪器设备：HYG-C 多功能摇床（太仓市实验设备厂），DGX-9243BC-1 电热恒温鼓风干燥箱（宁波海曙赛福实验仪器厂），Aglient-7890B/5977B 气相色谱-质谱联用仪（美国安捷伦公司），50/30 μmDVB/CAR/PDMS 萃取头（美国SUPELCO 公司）。

1.2 方法

材料预处理：选择采摘好的可可鲜果，在工作台上去壳取鲜可可豆（800±10）g 分别放置于1 L高硼硅玻璃罐中密封，置于50 ℃智能恒温箱中进行发酵。发酵期间每天对样品进行1 次搅拌处理，并每天采集发酵样品，采集后的样品置于32 ℃鼓风干燥机中，干燥3 d 后在研磨机中进行精细研磨，得到待测可可样品，样品编号见表1。

固相微萃取-气质联用：准确称取表1 中各可可待测样品2.0 g 于20 mL 密封顶空样品瓶中，使用型号为50/30 μm 的DVB/CAR/PDMS SPME纤维头插入GC 插入萃取瓶中，置于样品上方0.5 cm 顶空萃取30 min，萃取头插入GC 进样口解析5 min，每个样品重复3 次。

色谱条件：聚乙二醇（PEG）毛细管柱，DB-WAX（30 mm×0.25 mm， 0.25 μm）；升温程序为初始温度40 ℃保持4 min，以3 ℃/min 升温至96 ℃，保持3 min，再以1.5 ℃/min 升温至150 ℃，保持0 min；最后以10 ℃/min 升温到210 ℃，保持2 min，进样口温度为250 ℃；载氦气，流速为1 mL/min。

质谱条件：电离方式EI，电子能量为70 eV，离子源温度为250 ℃，传输线温度为250 ℃。扫描质量范围40～550 amu。

1.3 数据处理

GC/MS 实验数据通过安捷伦仪器自带软件进行处理，经计算机检索同时与NIST 17 谱库和Wiley 谱库相匹配，并结合相关文献，进一步确认香气物质的具体化学成分，按峰面积归一化法算出样品中各组分的相对含量，使用Origin 2021软件进行数据主成分分析和图像处理。

2 结果与分析

2.1 不同基因型可可豆发酵过程中挥发性香气成分种类组成分析

根据ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 可可发酵过程中挥发性香气成分的总离子流图组成，进行分谱库检索和相关资料分析，共检测出32 种挥发性香气化合物，属于醇类、酯类、酮类、酸类、吡嗪类、呋喃类、烯烃类7 类（表2～表4）。其中，醇类12 种、酯类11 种、酮类4 种、酸类2 种、吡嗪类1 种、呋喃类1 种和烯烃类1 种。ZYP11-9可可豆发酵过程中共鉴定出25 种化合物，其中醇类10 种、酯类8 种、酮类3 种、酸类2 种、吡嗪类1 种、呋喃类1 种，其中，2，5-二甲基呋喃、2-氨基丙酸、苯甲酸戊-2-基酯、戊二酸单乙酯、亚硝酸仲丁酯、乙二醇丁醚醋酸酯和乙酸苯酯7 种物质为特有挥发性成分；STS16 可可豆发酵过程中共鉴定出21 种化合物，其中醇类11 种、酯类4 种、酮类4 种、酸类1 种、吡嗪类1 种，其中，异丁醇、3-乙酰基-2-丁酮和戊二酸单乙酯3 种物质为特有挥发性成分；ZYP6-11 可可豆发酵过程中共鉴定出22 种化合物，其中醇类11 种、酯类5 种、酮类3 种、酸类1 种、吡嗪类1 种、烯烃类1 种，其中，3-蒈烯、3-羟基丁酸甲酯和乙酸仲戊酯3 种物质为特有挥发性成分。箱线图统计分析表明（图2），ZYP11-9 可可豆发酵过程中的挥发性香气成分组成为（12.50±3.31）种；STS16可可豆挥发性香气成分组成为（11.50±2.44）种；ZYP6-11 可可豆挥发性香气成分组成为（12.62±3.49）种。在3 种可可豆发酵中，ZYP6-11 可可豆在发酵过程中的挥发性物质变化较丰富，STS16 可可豆则更为稳定。

由图3 可见，ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 不同基因型可可豆挥发性成分的种类组成无差异，但是发酵过程中的种类组成和含量差异较大。发酵过程中3 种基因型可可豆挥发性香气成分的种类数量呈逐渐减少的趋势，且发酵过程中挥发性香气成分的数量存在显著差异。STS16 可可、ZYP6-11 可可豆发酵第5 天挥发性香气成分数量最少，与未发酵鲜豆挥发性成分相比分别下降33.34%和38.46%；ZYP11-9 可可于发酵第6 天挥发性香气成分数量最少，与未发酵鲜豆挥发性成分相比下降46.67%，其中醇类、酯类挥发性香气成分数量下降最为明显。由图4 可见，3 种基因型可可豆发酵过程中醇类、酸类挥发性香气成分的相对含量较高，其中ZYP11-9 可可豆发酵过程中醇类物质的相对含量基本不变，占57.22%～85.48%，酯类物质相对含量最高占12.63%；STS16 可可豆发酵过程中醇类物质的相对含量呈逐渐上升趋势，与未发酵鲜豆挥发性香气成分相比增长28.30%，酮類物质平均相对含量较高（10.21%±7.12%），在发酵第5 天达到峰值25.79%；ZYP6-11 可可豆的醇类物质相对含量呈逐渐下降趋势，发酵第7d 与未发酵鲜豆挥发性香气成分相比下降53.38%，主要原因为ZYP6-11 可可豆发酵6～7 d 其酸性挥发性物质较多，相对含量最高为45.46%。

2.2 不同基因型可可豆发酵过程中挥发性香气成分组成分析

可可发酵过程中醇类物质通常被描述为“水果和植物般”风味，较高的醇类含量也是获得花香和糖果味可可的关键[16]，ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 三种基因型可可发酵过程中主要的醇类化合物为2，3-丁二醇、2-庚醇、2-戊醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇和芳樟醇。2，3-丁二醇在可可风味评价中通常被描述为具有“水果味与黄油味”的香气特征[17]。2，3-丁二醇在ZYP11-9、STS16 未发酵可可鲜豆阶段中的相对含量分别为17.01%±8.30%和29.16%±16.32%，在发酵过程中呈逐渐增加的趋势，发酵完成后2，3-丁二醇的相对含量分别增加220.40%和94.56%；然而，ZYP6-11 可可豆发酵过程中的2，3-丁二醇含量呈先增后减的变化趋势，发酵第4 天其相对含量达到峰值59.65%±20.70%，相对含量增量为210.27%，但发酵完成后的2，3-丁二醇相对含量与其鲜豆期相比仅增长3.84%（表2～表4）。

2-戊醇、2-庚醇和芳樟醇被描述为具有“果香、柠檬草香和花香”的香气特征，同时有助于产生优质可可中的果味和花香[18-19]。ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 可可豆的整体发酵过程中2-戊醇、2-庚醇相对含量呈递减趋势，其中2-戊醇含量均于发酵第4 天处于最低，分别为0.38%±0.04%、0.13%±0.01%和2.73%±0.11%，与未发酵阶段相比分别减少97.38%、95.36%和92.01%；2-庚醇在ZYP11-9可可发酵第6 天达到最低含量（0.17%±0.02%），与鲜豆相比下降99.21%；在STS16 可可发酵第4天达到最低含量（0.41%±0.08%），与鲜豆期相比下降95.60%；在ZYP6-11 可可豆发酵第2 天达到最低含量（0.21%±0.06%），与鲜豆期相比下降96.81%。芳樟醇是可可豆挥发性物质中的主要醇类成分，对一些可可品种的花香和茶香有显著贡献[20]，芳樟醇在ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 可可发酵过中的相对含量均呈递增趋势，在发酵第6天或第7 天相对含量达到最大，分别为18.24%±3.59%、20.24%±3.02%和17.04%±6.23%（表2～表4）。

可可发酵过程中有机酸的浓度由于糖的代谢而增加，具有酸味和醋味的乙酸被认为是发酵豆类中气味活性最高的化合物，可可豆在发酵过程中被乙酸酸化，进行各种可可风味开发所需的生化修饰[10]。ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 可可豆发酵过程的乙酸含量变化规律不一致。ZYP11-9 可可豆的乙酸含量呈先升后降的变化规律，可可鲜豆的乙酸相对含量仅为2.43%±0.77%，发酵第3天达到峰值（33.27%±3.92%），而发酵第7 天降至7.33%±2.08%。STS16 可可鲜豆的乙酸相对含量高达22.61%±2.06%，发酵第1～2 天乙酸含量呈下降趋势，发酵第3 天乙酸相对含量达到峰值（32.37%±2.62%），但发酵第7 天乙酸相对含量降至10.83%±1.73%， 与鲜豆阶段相比约减少52.11%。然而，ZYP6-11 可可豆发酵过程中的乙酸含量呈递增趋势，未发酵鲜豆未检测到乙酸，发酵第1 天乙酸含量为4.17%±0.56%，发酵第6、7 天乙酸含量达45%，增长量为发酵第1 天的9.73倍（表2～表4）。

3-羟基-2-丁酮（乙偶姻）是可可、葡萄酒、黄油、草莓和乳制品的重要风味物质，被广泛用作食品增味剂[21]。3-羟基-2-丁酮在发酵过程中主要作为三甲基吡嗪的前体物质，而三甲基吡嗪为可可豆香气的重要气味活性成分，常散发出坚果味与青草味道[14]。ZYP11-9 与STS16 可可豆发酵过程中的3-羟基-2-丁酮相对含量均呈逐渐下降趋势，发酵前后相对含量相比分别减少75.06%和65.02%；ZYP6-11 可可豆发酵过程中的3-羟基-2-丁酮相对含量呈递增趋势，发酵前后相对含量增长50.12%。2，3，5-三甲基吡嗪在ZYP11-9、STS16可可豆发酵过程中的相对含量均呈递减趋势，其中在ZYP6-11 可可豆中含量下降幅度较大，发酵前后含量减少约82.50%。酯类是仅次于吡嗪类的重要挥发性化合物，主要来源于发酵厌氧阶段有机酸与醇的反应，可提供可可豆的水果风味[7， 22]。在3 种可可豆发酵过程中，γ-丁内酯在ZYP11-9和STS16 可可豆未发酵鲜豆中的相对含量分别为8.18%±0.62%和8.56%± 2.13%，在发酵第7 天分别为4.53%±0.57%和5.62%±2.49%，而γ-丁内酯在ZYP6-11 可可豆未发酵鲜豆中仅为3.99%±0.43%，在发酵第7 天为2.21%±0.49%（表2～表4）。

2.3 不同基因型可可发酵过程中主要香气成分分析

对3 种基因型可可豆不同发酵阶段挥发性物质进行主成分分析，结果表明，ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 可可豆发酵过程中PC1 与PC2 的方差总贡献率分别为95.90%、95.00%、89.40%，其主要香气成分相似，与2，3-丁二醇、乙酸、芳樟醇、2-戊醇、2-庚醇等挥发性香气成分相关性较强，但不同发酵阶段的主要香气成分存在差异。由图5A 可知，ZYP11-9 可可豆未发酵鲜豆与发酵过程的挥发性成分存在差异，发酵过程中的2-庚醇、2-戊醇、3-羟基-2-丁酮等挥发性物质含量与鲜豆（0A）的挥发性物质含量呈正相关，其中2-庚醇的相对含量高达21.64%±3.61%，其次为2-戊醇（ 14.55%±2.66%） 和3-羟基-2-丁酮（ 8.26%±1.31%）；乙酸、2，3-丁二醇、芳樟醇等挥发性物质与发酵时间呈正相关，其中2，3-丁二醇的平均相对含量最高达56.54%±12.00%，其次为乙酸（14.24%±3.32%）和芳樟醇（12.70%±2.69%）。由图5B 可知，STS16 可可豆的乙酸含量与未发酵鲜豆（0B）、发酵第3 天（3B）挥发性物质含量呈正相关，未发酵鲜豆中的乙酸含量为22.61%±2.06%，在发酵第3 天達最高（32.37%±2.62%）；2，3-丁二醇、芳樟醇、3-羟基-2-丁酮等挥发性物质与STS16 发酵时间呈正相关，其中2，3-丁二醇平均相对含量最高（53.26%±4.51%），其次为芳樟醇（14.72%±2.77%）和3-羟基-2-丁酮（8.90%±3.30%）。由图5C 可知，在ZYP6-11 可可豆发酵过程中，鲜豆（0C）、发酵第1 天（1C）挥发性物质主要有2-戊醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇等，其中2-戊醇相对含量高达34.73%±1.46%，其次为3-甲基-1-丁醇（8.34%±1.73%）和苯乙醇（6.71%±0.68%）；发酵第2～5 天的挥发性物质主要为2，3-丁二醇、芳樟醇、3-羟基-2-丁酮等，其中2，3-丁二醇相对含量高达52.97%±16.84%，其次为芳樟醇（9.41%±3.91%）和3-羟基-2-丁酮（5.74%±0.69%），发酵第6～7 天的挥发性物质主要为乙酸、2，3-丁二醇、芳樟醇等，其中乙酸相对含量高达45.13%±2.30%， 其次为2，3-丁二醇（ 20.08%±4.58%）、芳樟醇（16.68%±7.09%）。

由图6 可见，聚类热图直观地呈现了ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 不同基因型可可豆发酵过程中32 种挥发性成分的变化差异，第0～4 天发酵阶段产生的挥发性物质的变化明显高于第5～7 天，2，3-丁二醇、乙酸、芳樟醇、3-羟基-2-丁酮、2-戊醇、2-庚醇、3-甲基-1-丁醇等挥发性香气成分变化显著，这可能与可可发酵中复杂的微生物活动有关。TIGRERO-VACA 等[23]研究表明，可可豆中部分微生物菌种如酵母（Saccharomyces cerevisiae）、近平滑念珠菌（Candida metapsilosis）等在发酵过程中的活动有助于产生与果香、花香、巧克力味和杏仁味的香气相关的挥发性化合物。

3 讨论

可可挥发性化合物的数量和类型是影响可可品质的重要指标，也决定了可可的商业价值。近年来，在可可豆加工过程中已鉴定和识别的挥发性化合物约有600 种[24]。本研究以ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 可可种质资源为材料，利用HS-SPME-GC/MS 技术鉴定发现不同基因型可可豆香气成分物质种类主要由醇类、酸类、酯类、酮类、吡嗪类化合物组成，这与秦晓威等[25]、COUNET 等[26]的研究结论一致。本研究进一步发现，不同基因型可可豆的香气成分物质种类含量存在差异，其中ZYP6-11 的醇类含量较高，是STS16、ZYP11-9 的1.4 倍；ZYP11-9 的酯类含量较高，是ZYP6-11 的3.1 倍；STS16 的酸类物质含量较高，是ZYP11-9 的5.7 倍。RODRIGUEZCAMPOS等[16]研究认为醇类物质是影响可可果香风味的主要成分。其中，2-戊醇具有明显的水果和花卉香气特征，有利于可可制品的品质提高[27]。本研究结果表明，ZYP6-11 的2-戊醇相对含量达34.16%，是STS16 的12 倍。STS16 的乙酸相对含量较高，是ZYP11-9 的9.3 倍，而KADOW 等[28]研究表明，较高的乙酸含量会增强可可制品的酸味，从而降低品质。此外，在ZYP6-11 的香气成分中三甲基吡嗪类物质的相对含量较高，RAMLI等[29]研究表明，吡嗪类物质表现出坚果味、青草味，具有可可风味增强剂的特性。

可可发酵是一个自发的过程，伴随着挥发性物质的形成，有助于确定芳香可可豆的特性与质量[8]。本研究中，发酵结束后ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 的香气物质数量均有所减少，相对含量也有所变化。FRAUENDORFER 等[30]研究表明，一些短链羧酸如乙酸和异戊酸，在可可豆发酵的香气成分中占主导地位。本研究表明，ZYP6-11的发酵酸类物质变化幅度较大，在发酵中后期（第6～7 天）酸类挥发性化合物的相对含量显著增加，是ZYP11-9、STS16 的2.46 倍，其发酵具有明显的酸性风味，这些酸类物质的增加可能是可可浆中糖类物质代谢的结果，乙酸可以通过乙醇氧化产生[31]，同时这与RODRIGUEZ-CAMPOS 等[32]的研究过程中酸类挥发性化合物相对含量变化一致，表明部分品种可可豆经过长时间发酵（超过6 d）会增加如乙酸等酸类挥发性物质的含量。此外，在ZYP11-9 可可豆发酵中存在丙酸类物质，这类物质通常是在发酵结束后由芽孢杆菌属（Bacillus spp.）代谢产生，然而由于发酵时间过长引起的过度发酵，也会提高这些酸类物质的浓度[14]。ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 可可豆发酵过程中有17 种共有挥发性物质，5 种为醇类，分别为2-戊醇、3-甲基-1-丁醇、2-庚醇、2，3-丁二醇、苯乙醇，其香气变化特征与OBERPARLEITER 等[33]的研究结果一致，表现出较明显的代谢反应。在3 种基因型可可豆发酵过程中，3-甲基-1-丁醇的相对含量在发酵第0～4 天均出现明显下降，据AFOAKWA 等[34]研究表明，3-甲基-1-丁醇是一种戊醇，在发酵过程中被氧化为乙酸酯，并有助于麦芽风味与巧克力风味的形成。本研究进一步发现，ZYP11-9、STS16 在发酵过程中醇类物质的相对含量均较高，是ZYP6-11 的2.1 倍，与CAMU等[35]、GUEHI 等[36]的研究结论一致，醇类挥发性物质主要由酵母在发酵的厌氧阶段（发酵48 h）产生，而部分醇则通过氨基酸的热降解产生，并在后期被氧化成酸类或酯类，高含量的醇类挥发性物质则有利于获得带有花香或甜味的可可产品[18]。酯类与水果风味相关，是仅次于可可中吡嗪类物质的重要的挥发性化合物种类[37]。本研究表明，ZYP11-9、STS16、ZYP6-11 不同基因型可可豆发酵的酯类物质相对含量均有所减少，可能是发酵过程中酵母持续代谢的结果[38]。

4 结论

本研究表明，不同基因型可可豆发酵过程中的挥发性香气成分种类组成相似，由醇类、酸类、酯类、酮类、吡嗪类化合物组成，而部分挥发性香气成分的相对含量变化有差异，其中2，3-丁二醇、2-庚醇、2-戊醇、3-甲基-1-丁醇、苯乙醇、芳樟醇、乙酸、3-羟基-2-丁酮及2，3，5-三甲基吡嗪9 种共有香气物质在不同基因型可可豆发酵过程中的相对含量变化存在显著差异；并且，主要香气成分与发酵时间存在一定相关性，其中2，3-丁二醇、乙酸、芳樟醇、3-羟基-2-丁酮与可可发酵时间呈正相关，3-甲基-1-丁醇、丁内酯、苯乙酮等香气物质与发酵时间呈负相关。不同基因型可可豆发酵过程中的香气成分组成及含量变化存在一定差异，且主要香气成分与发酵时间存在一定相关性。研究结果为优质可可新品种的选育及应用提供参考依据。