无核荔枝僵果病的病原菌鉴定、入侵途径及快速检测技术

王伟博 李松刚 胡美姣 曹学仁 李敏 李焕苓 李芳 高兆银

关键词：无核荔枝；僵果病；病原菌；鉴定；检测

荔枝（Litchi chinensis Sonn.）是原产于我国的重要的热带果树之一。无核荔枝是海南选育的地方特色品种，其果大皮红，果肉晶莹、口感清脆无渣，食用时不吐核，备受消费者喜爱。随着荔枝栽培技术的提高，并蒂双生的无核荔枝成为无核荔枝生产的主流，在果实长至花生米大小时，通过疏除单果、有核果实，保留并蒂成对的无核果实，实现并蒂双生无核荔枝的生产，其售价高，是单果售价的2～4倍，经济效益显著[1-3]。近年来无核荔枝上发生了一种为害果实的新病害，与荔枝常见的果实病害，如炭疽病、霜疫霉病、酸腐病引起的果皮褐变，在树上或者采后果实腐烂不同，这种新病害主要为害幼果，果实长至蚕豆大小时，发病果实的外果皮局部颜色变暗，剖开后变暗部位内果皮发生不规则褐变，果实不再膨大，形成无肉僵果，命名为无核荔枝僵果病。该病害仅导致幼果发育停止、内果皮呈灰褐色，褐变位置多发生在果实纵茎中间位置，较少发生在果柄和果顶端部位，这种蚕豆大小的僵果一直维持到果实成熟期不腐烂，果皮比正常果实提前3～7 d 变红。如果并蒂双生无核荔枝果实中有1个果实发生这种病害，其经济价值将显著降低。2019—2021 年本课题组调查该病害的发病率在5%～15%之间，严重影响并蒂双生果实的生产，造成严重的经济损失。该病害的症状与GAO 等[4]报道的桂花香荔枝变红镰刀菌（Fusarium incarnatum）果腐病的症状相似，不同的是变红镰刀菌果腐病的症状为果实外观无明显病变表现，近果柄处果皮变硬，剖开后内果皮果柄周围呈灰褐色褐变，发病部位在果柄處或近果柄处居多，变红镰刀菌果腐病不影响桂花香荔枝果肉的正常生长和食用品质，果实可以正常成熟。而目前国内外均未见无核荔枝僵果病的报道。本研究对无核荔枝僵果病的病原菌进行分离、鉴定，并研究其入侵途径和分子快速检测、诊断技术，为该病的鉴别和高效防治提供技术支撑。

1 材料与方法

1.1 材料

无核荔枝果实（感病果实和健康果实）采自海南澄迈无核荔枝基地。

1.2 方法

1.2.1 病原菌的分离采回感病无核荔枝果实后，参照胡美姣等[5]的方法进行病原菌分离。从PDA 培养分离物中挑取菌丝置于28 ℃恒温条件下培养2～3 d，长出菌丝后在菌落边缘用无菌镊子剪取形态单一的小菌丝块接种至PDA 培养基进行纯化。培养6 d 待菌落长出孢子后采用标记法获得单孢分离物，用于后续致病性试验、病菌鉴定和检测等研究。

1.2.2 致病性测定致病力测定方法参考胡美姣等[6]的方法，选取果实纵经约1 cm，大小一致（约花生米大小）的健康果实，采用无刺伤接种和昆虫针刺伤果面接种2 种方式。用打孔器将培养7 d的单孢分离菌株PDA 培养基打成直径为5 mm 的菌饼，菌丝一面贴到荔枝果皮上，用脱脂棉保湿，24 h 后去除脱脂棉，每个菌株接种12 个果实，3 d后统计发病情况，共接种64 株单孢分离物，以空白PDA 培养基琼脂饼为对照（CK）。

1.2.3 病原菌鉴定（1）形态学鉴定。培养7 d后，在徕卡生物显微镜下观察病原菌分生孢子和产孢结构，根据形态学进行病原菌鉴定。（2）分子鉴定。使用CATB 法提取病原菌DNA[7]，进行ITS、RPB2、EF-1α 扩增。ITS 扩增引物序列参照WHITE 等[8]设计的真菌rDNA-ITS 序列，PCR 条件参考胡美姣等[5]的方法。RPB2、EF-1α 基因的引物序列及PCR 条件参照WANG 等[9]的方法。凝胶电泳检验合格后将产物送生工生物工程（上海）股份有限公司测序，基于ITS 测序结果在NCBI 上进行比对，确定病原菌的属，再从NCBI上下载相关属种的序列及外群序列，基于RPB2、EF-1α 构建系统发育树，确认病原菌的生物学种类[10]。

1.2.4 病原菌的侵染途径试验田间幼果经农事活动碰伤、自然风力较大擦伤以及昆虫口器刺伤等伤害后，果皮受伤部位会流出明显的黑色汁液。选取纵径为10 mm 的3 串健康果实，每串4 个果实，共12 个流黑汁的果实进行侵入途径试验。接种方法和发病统计同1.2.2。以15 cm×20 cm 大小的纱网套住果穗，每个纱网放入5 只荔枝蝽，24 h后选择果皮变黑的果实接种病原菌，以表面无损伤的果皮接种病原菌为对照（CK），探究病原菌的侵染途径。

1.2.5 病原菌的分子检测以伯氏镰刀菌和分离获得的其他镰刀菌属真菌基因组DNA 为模板，利用镰刀菌属通用引物TUB2F/TUB2R 对其进行PCR 扩增，PCR 产物委托生工生物工程（上海）股份有限公司进行纯化和测序。根据测序获得的序列信息，采用MEGA 11 软件进行序列比对，找到伯氏镰刀菌和其他镰刀菌基因序列的差异性位点，利用NCBI 设计检测伯氏镰刀菌的特异性引物序列，选用契合度最高的一对引物F1D/R1D 进行PCR 扩增，根据凝胶电泳结果判断引物的特异性。引物由生工生物工程（上海）股份有限公司合成。为了进一步鉴定筛选获得的伯氏镰刀菌检测引物的特异性，以分离获得的所有菌株为测试对象，进行PCR 检测，根据凝胶电泳结果判断引物的特异性；从盛花期后第10 天开始取样（不同生长期共取9 次样，编号为1～9），每个时期取样18 个单果，表面经75%酒精消毒30 s，用灭菌滤纸吸干水分，单果包装置于–80 ℃保存备用。以不同时期的单果DNA为检测目标进行PCR 检测，使用Plant Genomic DNA Kit 试剂盒[天根生化科技（北京）有限公司]进行果实DNA 的提取，根据扩增结果判断病原菌入侵情况。

1.3 数据处理

试验数据采用Excel 软件进行统计分析，用SAS 9.1 软件进行差异显著性分析（P<0.05）。

2 结果与分析

2.1 病原菌的分离、纯化与致病性测定

从发病无核荔枝果实中分离获得64 株菌株，根据形态特征分为14 种，每种菌株接种1 株，所有菌株均未能侵染无刺伤果实，导致刺伤果实发病的共有8 株，分为3 个种类，菌株编号分别为SLZ-1-2、02、32。其中致病性最强的病原菌株为SLZ-1-2，发病症状与自然发病果实症状一致（图1）。从刺伤接种发病果实中，再次分离获得的菌株与SLZ-1-2 一致，表明菌株SLZ-1-2 为本研究的主要致病菌。

2.2 病原菌的形态学鉴定

病原菌菌株SLZ-1-2 在PDA 平板培养基上生长的菌丝密集，气生菌丝呈淡黄色，菌落背面呈淡棕色（图2）。分生孢子的形态呈镰刀型，整体稍弯曲，1～5 个分隔。根据培养特征和形态特征，鉴定该病原菌为镰刀菌（Fusarium）。

2.3 病原菌的分子鉴定

将病原菌菌株SLZ-1-2 的RPB2 和TEF1 序列与GenBank 中下载的27 个菌株的相关基因序列进行同源性比对，以PhyloSuite 进行拼接，用Cipres 以伯氏镰刀菌（F. pernambucanum）为外群构建系统发育树（图3）。本研究致病菌株SLZ-1-2与伯氏镰刀菌以100%的高支持率聚为一支，支持形态学鉴定结果，因此，基于形态学和分子生物学特征，将该致病菌株鉴定为伯氏镰刀菌（F.pernambucanum）。

2.4 病原菌的入侵途径

在田间无刺伤接种病原菌时，果实不发病，机械损伤接种后发病率为92.24%；刺吸式害虫为害后，發病率为82.27%（图4）。因此，无核荔枝果实表面出现损伤时病原菌能入侵致病。

2.5 伯氏镰刀菌引物的特异性验证

用 F1D（5-CCTGGCAGGAGTGATGAAAC-3）/R1D（5-AATCAGACCGGTCAGTGCGT-3）对伯氏镰刀菌和分离获得的其他镰刀菌属真菌及非镰刀菌属真菌进行PCR扩增以验证引物的特异性，结果表明，仅伯氏镰刀菌基因组DNA 可以扩增出1 条220 bp 左右的特异性片段，与预期目标条带大小一致，而从无核荔枝上分离供试的3种镰刀菌属真菌和其他非镰刀菌属真菌无目的条带出现，CK 也无目的条带出现（图5，图6），试验结果验证了该对引物的特异性，可用于田间检测病原菌。

2.6 发病果实的分子检测

在田间随机采集无核荔枝僵果果实，利用特异性引物F1D/R1D 对其进行PCR 扩增，结果显示，僵果均可以扩增出目标条带，而CK 无条带产生。说明该特异性引物可以用于生产中无核荔枝僵果病病原菌及病果的快速检测（图7）。

2.7 病原菌入侵时期

从表 1 可以看出，无核荔枝幼果期带菌率较高，特别是果实纵径小于10 mm 时，果实带菌率比较高，随着荔枝果实的生长，果实角质层逐渐增厚，带菌率逐渐降低。分别以田间随机采集的果实和伯氏镰刀菌基因组DNA 为模板，利用特异性引物F1D/R1D 对其进行PCR 扩增，结果显示，部分无症状幼果可以扩增出目标条带，其中以果实纵径为3.2～4.8 mm 时期检出率最高，说明此阶段为病原菌的主要入侵时期，果实大于9.8 mm后，病原菌入侵逐渐降低。

3 讨论

镰刀菌属真菌病害是造成植物发生病害的主要病原之一，如枯萎、腐烂和枯死[11-15]。OMAR等[16]报道了由伯氏镰刀菌（F. pernambucanum）引起的马来西亚芒果叶斑病。GUO 等[17]报道了由伯氏镰刀菌引起的我国芒果的叶斑病。ZHANG等[18]报道了由伯氏镰刀菌引起的甜瓜僵果病，发病部位呈灰褐色、水渍状，发病后期可导致整个果实腐烂，果实表面布满白色至玫瑰红色的霉层。LU 等[19]报道了由伯氏镰刀菌引起的李叶枯病，发病叶片边缘或尖端出现不规则的棕色斑点，发病后期，整个叶片枯萎褐变、卷曲或脱落。本研究发现引起无核荔枝的新型僵果病的病原菌为伯氏镰刀菌。该病原菌主要为害幼果，发病时幼果果实外观无明显变化，但无核荔枝完成疏果后，果实长至蚕豆大小时，发病果实的外果皮变暗，剖开后内果皮发生不规则褐变，果实不再膨大，形成僵果。

GUO 等[17]的研究表明，由伯氏镰刀菌引起的芒果叶斑病在叶片表面存在伤口时才能入侵致病。本研究中也发现，通过农事操作，如打药、施肥等人工擦伤，大风后机械摩擦损伤，荔枝蝽为害等方式，在荔枝果实表面造成伤口时，伯氏镰刀菌则入侵致病，果皮无伤口时不致病。经过全面的田间调查，未发现该病原菌为害无核荔枝的嫩梢和叶片。

分子检测技术以其高效、灵敏、简便的特点，已广泛应用于植物病害的检测[20]。李亭潞等[21]利用环介导等温扩增（LAMP）技术建立了荔枝霜疫霉和炭疽病的快速检测技术。而利用PCR 或qPCR（quantitative real-time PCR）技术可检测到的植物病原已达50 余种[22]。本研究根据伯氏镰刀菌的序列信息，利用MEGA 11 软件与其他镰刀菌进行序列比对，找到差异性位点，合成引物F1D/R1D 进行PCR 扩增，对带致病菌果实的检测率达到100%。

无核荔枝是海南本地选育的优良品种，其独特的品质和生产模式，以及高价值的经济效益已经成为海南重要的农产品地理标志产品。无核荔枝新型僵果病果实的果皮受伤后，由伯氏镰刀菌入侵为害，该菌主要通过农事操作、风、刺吸口器昆虫造成荔枝果皮伤口后侵入感染，果实纵径为3.2～4.8 mm 时为病原菌的主要入侵时期。本研究建立的无核荔枝僵果病的快速检测方法，不仅灵敏度高，能区分其他属病原菌，也能区分亲缘关系较近的镰刀菌属真菌。可为僵果病的早期预防，遏制病害的发生和传播提供技术保障。但该病原菌是否为害叶片，以及是否入侵如蒂蛀虫等其他因素造成的幼果伤口有待进一步研究。