澳洲石斛疫病病原菌的鉴定及其杀菌剂毒力测定

林接英 吴浩芳 麦章龙 张云霞

关键词：澳洲石斛；棕榈疫霉；毒力测定

石斛属（Dendrobium）是兰科植物第二大属[1]。我国石斛兰资源丰富，主要分布在华南、西南和台湾等地区[2]。石斛分为观赏石斛和药用石斛[3]，澳洲石斛（D. kingianum）属于观赏石斛，原产于澳大利亚，随国外观赏洋兰的引进和推广而逐渐进入我国兰花市场[4]。因其花型小、色彩绚丽和长势强，近年来越来越受到国内花卉爱好者喜爱，成为最具观赏性的花卉种类之一[5]。

然而，病害是限制石斛兰生产，影响其观赏价值和经济价值的重要因素之一。目前，国内外已报道的石斛（Dendrobium spp.）植物主要病害有镰刀菌（Fuarium spp.）引起的茎腐病、齐整小核菌（Sclerotium rolsii）引起的白绢病、棕榈疫霉（Phytophthora palmivora）引起的疫病[6]、终极腐霉（Pythium ultimum）引起的黑腐病[7]和炭疽菌（Colletotrichum spp.）引起的炭疽病[6]等。其中，根茎部病害对其生产影响较大。王国荣等[8]对浙江省杭州市铁皮石斛（D. officinale）上发生的2 种茎腐病进行了研究，结合形态学特征和rDNA-ITS 基因序列分析，明确其病原菌为齐整小核菌（S. rolsii）和尖孢镰刀菌（F. oxysporum），2 种病害的发病率达到30%以上。曹瑱艳等[9]对浙江省金华市发生的铁皮石斛根腐病菌进行了研究，结果发现厚垣镰刀菌（F. chlamydosporum）是其主要病原菌。李梦娇[10]将云南铁皮石斛茎腐病的病原菌鉴定为尖孢镰刀菌，该病害在云南的发病率在20%以上。但是，以上相关病害的报道主要集中在铁皮石斛和金钗石斛等药用石斛上。目前，尚无澳洲石斛相关病害的报道。

近年来，笔者在病害调查中发现，广东某花场的澳洲石斛病害发生严重，受害植株叶片初期呈水渍状，叶片和茎基部腐烂，后期干枯死亡，发病率达20%。为明确该病害的病原菌种类，为病害防控提供理论依据，本研究对其病原菌进行了鉴定，并针对病原菌进行了杀菌剂的室内筛选。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 供试样品 发病的澳洲石斛采自广东某花场，接种植株为健康的澳洲石斛。

1.1.2 供试培养基 马铃薯葡萄糖琼脂（PDA）培养基[11]、马铃薯葡萄糖（PD）培养液[12]、水琼脂（WA）培养基[13]和V8 培养基[14]。采用PDA 培养基进行菌株分离、菌种保存和菌落形态观察，采用WA 培养基纯化菌株，采用V8 培养基诱导疫霉孢子囊和厚垣孢子，采用PD 培养液培养接种菌[15]。

1.1.3 供试杀菌剂 供试杀菌剂共10 种，分别為：80%代森锰锌WP（美国陶氏益农公司），78%百菌清WP[先正达（苏州）作物保护有限公司]，50%嘧菌酯WG（河北冠龙农化有限公司），80%三乙膦酸铝WP（利民化学有限责任公司），68%精甲霜灵·代森锰锌WG（瑞士先正达作物保护有限公司），35%甲霜灵WP（浙江禾本科技有限公司），23.4%双炔酰菌胺SC（宁波石原金牛农业科技有限公司），50%烯酰吗啉WG（河北冠龙农化有限公司），72.2%霜霉威盐酸盐AS[拜耳作物科学（中国）有限公司]，50%多菌灵WP（上海悦联化工有限公司）。

1.2 方法

1.2.1 病原菌形态学鉴定 （1）病原菌的分离。采用常规组织分离法[8]。取发病植株的叶和茎秆，冲洗晾干，在病健交界处切取约5 mm×5 mm 的小块，75%乙醇消毒10～20 s，2.5%次氯酸钠溶液消毒10～20 s，无菌水漂洗3 次，最后用无菌滤纸吸干组织块表面的水分，移至PDA 平板上，于25 ℃恒温培养。

（2）菌株的纯化。采用顶端菌丝法[8]。待菌落长出后，挑取边缘的顶端菌丝移至新的PDA 平板上。培养2～3 d 后，取少量菌丝在WA 培养基上培养1 d，于显微镜下再次切取顶端菌丝，移至新的WA 平板上培养1 d，再切取顶端菌丝。重复3 次，获得纯化菌株，于13 ℃冰箱保存备用。

（3）菌落形态特征观察。纯化菌株转接至PDA 平板上置于26 ℃下培养，12 h 光照/12 h 黑暗循环交替。分别于第3 天和第5 天测量菌落直径，拍照并记录菌落形态特征[15]。

（4）显微形态特征观察。纯化菌株转接至V8平板上置于26 ℃、12 h 光照/12 h 黑暗循环交替培养。5 d 后观察孢子囊及厚垣孢子形态并测量大小，孢子囊及厚垣孢子各测30 个[15]。

1.2.2 病原菌分子鉴定 （1）真菌基因组DNA的提取。纯化菌株转接至PDA 平板上培养4 d，收集菌丝，采用CTAB 法提取菌株基因组DNA。

（2）PCR 扩增和测序。采用TUBUF2 和TUBUR1 引物对β-tubulin（tub）基因进行扩增[16]。

PCR 反应程序为：95 ℃预热3 min；94 ℃变性30s，56 ℃退火45 s，72 ℃延伸1 min，循环35 次；72 ℃终延伸10 min，于17 ℃保存。PCR 产物送至广州天一辉远基因科技有限公司测序，将测序结果输入NCBI 数据库（https：// www.ncbi.nlm.nih.gov/）进行同源性比对。

（3）系统发育树的构建。从NCBI 网上下载可信度高的相关序列，在MAFFT 网站（https：//mafft.cbrc.jp/）进行序列比对，采用BioEdit 软件进行序列剪切。以Pythium aphanidermatum 作为外群，在CIPRES 网站（http：//www.phylo.org/）用RAxML-HPC2 on XSEDE （8.2.8）工具采用最大似然法（maximum likehood， ML）构建系统发育树，设1000 次重复。

1.2.3 致病性测定 纯化菌株转接至PD 培养液中震荡培养4 d，过滤得到菌丝，配置成3%（m/V）的菌丝悬浮液用于接种。从心叶部位浇注2 mL菌丝悬浮液，套袋保湿2 d。以接种无菌水作为对照（CK）。每个处理重复3 盆。接种植株置于25 ℃植物培养室中培养，观察并记录发病情况。

1.2.4 杀菌剂对病原菌的毒力测定 （1）含毒培养基的配置。根据杀菌剂的推荐浓度进行预实验。在预实验的基础上，选择各药剂对病原菌菌丝生长抑制率在10%～90%范围内的浓度；每种杀菌剂按等比设置5 个浓度梯度。按杀菌剂的有效成分含量分别用无菌水稀释成一定浓度梯度的母液，在PDA 培养基中加入已配制好的杀菌剂母液，制成不同浓度梯度的含药平板。在PDA 培养基中加入等量的无菌水作为空白对照。

（2）菌丝生长速率的测定。菌株转接至PDA平板培养5 d，用打孔器（d=6 mm）在菌落边缘打取菌饼，移至含药平板的中央，每个浓度3 个重复。培养皿置于26 ℃下培养。待对照菌落长满培养皿时，采用“十”字交叉法测量菌落直径，计算平均值。按以下公式计算抑菌率：抑菌率=[（对照菌落直径-处理菌落直径）/（对照菌落直径-菌饼直径）]×100%；再算出每种药剂的有效浓度，每种药剂使用抑菌率和有效浓度2 组数据在DPS统计分析软件进行数值型数据机值分析，求出10种药剂的毒力回归方程、致死中浓度（EC50）和相关系数（r）。

2 结果与分析

2.1 澳洲石斛疫病的症状及致病性测定

该病害主要为害植株的茎杆和叶片。受害茎秆变褐，软腐，逐渐向上向下扩展，后期皱缩。感病叶片初期为水渍状、暗绿色湿腐，后期叶片干枯脱落，植株死亡（图1A～图1C）。

接种植株7 d 后开始发病，新叶接种部位初期水渍状，逐渐变褐色，而后扩展成湿腐状；发病部位沿叶片向下扩展，茎秆逐渐变褐，软腐（图1D、图1E）。接种14 d 左右，叶片干枯，茎秆皱缩，后期植株死亡（图1F）。对照植株未表现症状（图1G～图1I）。

2.2 澳洲石斛疫病病原菌的培养性状及显微形态

在 PDA 培养基上澳洲石斛疫病病原菌的菌落呈圆形（图2A，图2B），白色，絮状，边缘整齐，生长速率为6～7 mm/d。孢子囊倒梨形（图2C～图2E），多顶生，具有明显乳突，大小为（39～80）μm×（23～40）μm （ 平均大小为59 μm×31 μm）；厚垣孢子无色，近圆形，顶生或间生（图2F，图2G），直径为25～43 μm（平均大小为33 μm）。该病原菌的形态特征与郑小波[17]描述的棕榈疫霉（P. palmivora）基本一致。

2.3 澳洲石斛疫病病原菌的分子鉴定

采用引物TUBUF2 和TUBUR1 进行tub 基因片段扩增，得到约900 bp 的产物。将产物进行测序，获得的序列在NCBI 网站进行BLAST 比对分析，发现供试病原菌菌株（NCBI 登录号OP404090和OP404091）与P. palmivora（NCBI 登录号MAFF235788）的相似度为99%。

利用NCBI 上下载的菌株和供试病原菌菌株基于tub 基因构建ML 系统发育树[16]，结果显示，供试病原菌的2 个菌株SHL918、SHL921 与P.palmivora 位于同一分支，支持率为100%，亲缘关系较近（图3）。

因此，根据形态学特征和系统发育分析，将引起澳洲石斛疫病的病原菌鉴定为棕榈疫霉（P.palmivora）。

2.4 杀菌剂对澳洲石斛疫病病原菌的抑制作用

毒力测定结果表明，供试的10 种杀菌剂中以双炔酰菌胺、烯酰吗啉、甲霜灵和精甲霜灵·代森锰锌4 种杀菌剂对澳洲石斛疫病病原菌棕榈疫霉的毒力较高，EC50 分别为0.000 03、0.0628、0.2381、0.5457 μg/mL；其次是百菌清、嘧菌酯和代森锰锌， EC50 分别为2.1811 、7.0083 、8.1427 μg/mL。而霜霉威盐酸盐和三乙膦酸铝的抑制效果差，EC50 均大于100 μg/mL；多菌灵基本无抑制作用，EC50 大于1000 μg/mL。10 种药剂的相关系数范围在0.9726～0.9946 之间，说明药剂浓度与抑制作用呈显著正相关（表1）。

3 讨论

在形态学特征观察的基础上，结合tub 基因的系统发育分析，将引起澳洲石斛疫病的病原菌鉴定为棕榈疫霉（P. palmivora）。棕榈疫霉侵染澳洲石斛引起疫病为首次报道。石斛属植物疫病已有相关研究，病原物多为烟草疫霉（P. nicotianae）。李静等[18]和王晓阳[19]分别对浙江铁皮石斛（D. candidum）和广东金钗石斛（D. nobile）发生的疫病进行了研究，发现其病原菌均为烟草疫霉（P. nicotianae）。TAO 等[20]将云南思茅的4 种石斛植物（D. thyrsiflorum、D. chrysanthum、D.aurantiacum 和D. chrysotoxum）的疫霉病菌也鉴定为烟草疫霉。而李梦娇[10]结合形态学特征和ITS 序列分析发现，引起云南德宏铁皮石斛（D.candidum）疫病的病原菌为棕榈疫霉。但是，目前尚无棕榈疫霉侵染澳洲石斛的报道。

棕榈疫霉（ P. palmivora ） 属于卵菌门（Oomycota）霜霉科（Peronosporaceae）疫霉属（Phytophthora）。该菌是一种重要的植物病原菌，主要分布在热带和亚热带地区，寄主范围广，包括果树、蔬菜和观赏植物等170 余种植物[21]。棕榈疫霉能侵染植物的根、茎、叶和花等各部位，引起根茎腐、叶片凋萎或脱落，严重时导致植株死亡，给生产带来重大损失。据报道，棕榈疫霉能侵染榴莲（Durio zibethinus）的各个部位，引起根腐、茎枯和果腐等，在东南亚国家造成的经济损失达10 亿美元[22]。该菌还可以侵染可可（Theobroma cacao）引起黑果病，该病害每年在全球造成的产量损失在20%～30%之间[23]。棕榈疫霉也是观赏植物上的重要病原菌。油棕（Elaeisguineensis）芽腐病是由该菌引起的一種毁灭性的病害，2016 年该病害在哥伦比亚爆发，造成的经济损失达2.5×108 美元[22]。该菌还能侵染米兰（Aglaia odorata）、蝶兰（Phalaenopsis wilsonii）、丝兰属（Yucca sp.）和长寿花（Kalanchoe blossfeldiana）等10 余种观赏植物[17， 24-25]。本课题组在广东发现的澳洲石斛疫病，为害严重时可导致植株死亡，发病率达20%。由于棕榈疫霉在生产上的危害性，因此应对该病害引起重视。

进一步选用10 种杀菌剂对澳洲石斛疫霉病病原菌棕榈疫霉进行室内毒力测定发现，双炔酰菌胺、烯酰吗啉、甲霜灵和精甲霜灵·代森锰锌4种杀菌剂对其毒力较强，研究结果可为石斛兰疫病的田间防控提供理论依据。程东美等[26]对棕榈疫霉引起的一品红疫病进行了室内毒力测定和田间防效试验，发现双炔酰菌胺和精甲霜·锰锌具有较好的室内毒力和大田防效，而三乙膦酸铝、霜霉威和多菌灵的抑菌效果较差。王自然等[27]研究发现50%烯酰吗啉和68%精甲霜·锰锌对引起柠檬苗疫病的棕榈疫霉抑菌效果较好。本研究结果与以上研究基本一致。但是，由于杀菌剂的室内毒力测定结果不能完全反映其大田防效，因此，本研究筛选出的4 种杀菌剂的田间防效还需进一步的大田验证。