小鼠螺旋神经节神经元的分离和A型钾通道的电生理特性

邓嘉虹,蔡春春,梁传余,姜鹤群,张 林

(1.云南省第一人民医院耳鼻喉科,昆明 650032;2.四川大学华西医院耳鼻喉科,成都 610041)

耳蜗螺旋神经节神经元(spiral ganglion neuron,SGN)的体外机械分离及酶解是在体外实验条件下研究听觉传导通路中神经元的形态功能和特性的重要方法。由于耳蜗骨化常发生于哺乳动物生后极短时间内,使SGN的体外分离和酶解尤为困难。国内能进行SGN研究的实验室通常采用直接酶解的方法,而比较直接酶解和机械分离后酶解,前者因应用蛋白酶浓度高较后者对神经细胞突起的损伤更大,因此本研究选用出生1～6 d的乳小鼠进行SGN的机械分离、酶解、免疫细胞化学鉴定。SGN的A型钾通道具有激活迅速、失活迅速的特点,利用全细胞膜片钳技术对通道电生理特性进行记录和分析,可以进一步研究听觉传导通路的机理。现报道如下。

1 材料与方法

1.1 SGN细胞分离、酶解与鉴定

1.1.1 SGN的体外分离 选用出生1～6 d发育正常的昆明种乳小鼠,共10只(20耳),在解剖显微镜(Laica公司生产)下沿小鼠头颅矢状面正中剖开,分别去除大脑和小脑组织,在枕骨大孔正上方找到并取出耳蜗组织,置入盛有 pH 7.4的Hank′s平衡盐溶液中。高倍镜下分离并去除骨性耳蜗。同样方法分离对侧。将分下之膜性耳蜗沿螺旋缘处将外侧血管纹、Corti′s器去除,仅剩余内侧螺旋神经节组织部分,将神经组织轻柔的分离并切割,避免损伤神经元细胞。

1.1.2 SGN的酶解 将SGN组织块仔细吸入小瓶中,静置后吸去上层Hank′s平衡盐溶液,并用 D-Hank′s平衡盐溶液洗涤组织块。将解冻的2%的胰蛋白酶原液1 mL加入盛有SGN组织块的小瓶中孵育,并间或轻柔摇晃。酶解完毕后加入含胎牛血清的细胞培养液终止酶解,并进行机械吹打。将细胞悬液离心后吸出细胞悬液,静置在经多聚赖氨酸处理过的培养皿中的盖玻片上贴片,随时在倒置相差显微镜下观察细胞贴壁情况,并用细胞外液小心置换含血清的培养液,直至细胞外液清澈。

1.1.3 免疫细胞化学染色 采用1∶100小鼠源神经微丝200单克隆抗体(Sigma,N-0142)作为一抗,1∶100异硫氰酸盐荧光素标记的山羊抗小鼠抗体(北京中山公司生产)作为二抗对细胞进行免疫荧光细胞化学染色鉴定,阴性对照用磷酸盐缓冲液(PBS)或山羊血清替代一抗反应。荧光显微镜下显亮绿色的细胞即阳性细胞,即SGN细胞。

1.2 溶液成分

1.2.1 电极内液 成分(mmol/L):KCl 112,MgCl22,CaCl20.1,EGTA 11,Hepes 10,用KOH调节 pH值为 7.4,调节渗透压为310 mOsm/L。

1.2.2 细胞外液 成分(mmol/L):NaCl 137,KCl 5,CaCl21.7,MgCl21,葡萄糖 17,蔗糖 50,Hepes 10,用 NaOH 调节pH值为7.5,调节渗透压为300 mOsm/L。

1.2.3 终止酶解用细胞培养液 90%杜伯科改良的伊格尔培养基,10%胎牛血清,pH值为7.3～7.4。

1.2.4 A型钾通道阻滞剂 4-氨基吡啶(4-AP)的浓度为0.15 mmol/L,为了更好地观察外向A型钾通道电流,应用0.05 μ mol/L的 TTX(河豚毒素)在细胞外阻滞内向钠电流。

1.3 SGN细胞A型钾通道的电生理特性

1.3.1 全细胞电压钳模式的形成和细胞外给药 采用三步拉制仪拉制硅硼玻璃微电极,并在电极尖端涂布硅酮树脂和进行热抛光,使玻璃微电极尖端直径小于 1 μ m,阻抗为 3～7 mΩ。在微操纵仪的推动下,让玻璃微电极尖端接触SGN细胞膜,并应用负压抽吸使电极尖端和细胞膜形成高阻封接,封接电阻在10 gΩ以上,对膜片造成电化学隔离。高阻封接稳定后,通过负压抽吸使吸附于电极尖端的一小片细胞膜破裂,从而形成全细胞的膜片钳记录模式。实验使用“Y管”胞外给药装置进行局部细胞外微灌流给药。Y管给药尖端距目标细胞100～200 μ m,药液高于 Y管20～40 cm以便其能有足够的重力流出Y管,该给药系统能在20 ms内使目标细胞周边的外液完全被交换。

1.3.2 A型钾通道电流记录参数的设定 激活刺激参数,钳制电压(VH):-100 mV(VH1),-60 mV(VH2);命令电压:由-120 mV至+40 mV,步长10 mV,时程500 ms。失活刺激参数,VH:-100 mV,给予-120 mV至+30 mV的预脉冲,步长10 mV,再给予+40 mV的实验脉冲,两脉冲时程均为500 ms。恢复刺激参数,VH:-100 mV,给予+40 mV的双脉冲刺激,间隔10 ms,并以5 ms增益逐渐增大。

2 结 果

2.1 SGN的分离和免疫细胞化学鉴定 所有小鼠耳蜗SGN细胞的机械分离和酶解均获成功。在倒置相差显微镜下观察SGN细胞稍呈椭圆形,胞体边缘光滑,细胞透明,折光性良好,并可见胞质颗粒。细胞大多数有两个突起,少数有一个突起,并且还发现极少数细胞有三个突起(封3图1)。免疫细胞化学染色显示SGN细胞胞体呈现明显的亮绿色,可见椭圆形的胞体和神经突起,显阳性,见封3图2。

2.2 A型钾通道的记录和分析

2.2.1 A型钾通道的激活、失活和恢复 在细胞外液中加入河豚毒素(TTX)抑制内向钠电流后,应用-100 mV及-60 mV两个不同的钳制电压,25～50 ms的预脉冲时间,得到两个外向电流图形,两图相减后得到分离出的A型钾电流,表现为瞬间活化,迅速失活的外向电流特性,可见电流图和电流-电压关系曲线(图3、4)。A型钾通道在-60 mV迅速活化,于+40 mV达到峰值,对其进行拟合得到其活化时间常数(τ act)为(0.785±0.04)ms,其二分之一最大活化电压(V1/2)为-2.5 mV,斜率k为3.4 mV(n=30)。

给予-120 mV至+30 mV的预脉冲,步长10 ms,激活A型钾通道,再给予+40 mV的实验脉冲,可以记录到A型钾通道的失活过程(图5)。其失活过程符合二次幂方程,失活时间常数(τ inact)分别为(150.5±19.5)ms和(32.5±5.1)ms,其二分之一最大失活电压(V1/2)为-72.3 mV,斜率k为3.7 mV(n=30)。

将细胞钳制于-100 mV,给予两个+40 mV的实验脉冲,两脉冲间隔时间从10 ms逐渐增大(增益为5 ms),可以记录到A型钾通道的恢复情况(图6),其恢复过程也符合二次幂方程,恢复时间常数(τ rec)分别为(108.3±12.6)ms和(23.9±2.9)ms(n=8)。

2.2.2 4-AP对A型钾通道的阻滞和洗脱 4-AP为一种透膜的钾通道阻滞剂,对A型钾通道的作用较延迟整流钾通道强,在细胞外液中加入0.15 mmol/L的4-AP,A型钾通道电流峰值明显减小,并且随着细胞外液中4-AP的剂量增大,A型钾电流峰值逐渐变小。当4-AP作用稳定以后,用细胞外液逐渐洗脱4-AP,A型钾电流恢复到加药以前的水平,见图7。

图3 A型钾电流图

图4 A型钾通道电流I-V曲线

图5 A型钾通道的失活曲线

图6 A型钾通道的恢复曲线

图7 4-AP对A型钾通道电流的影响

3 讨 论

螺旋神经节神经元细胞的胞体位于螺旋神经节内,是听觉传导通路上的第1级神经元,属高度分化的终末细胞。哺乳动物和人听神经的神经元细胞体位于耳蜗骨螺旋板与蜗轴相接处的Rosenthal隧道里,形成螺旋神经节。根据细胞大小、神经突起的形态和是否具有髓鞘,SGN分为两型:Ⅰ型细胞为双极神经元,占SGN细胞的绝大多数(95%),它与内毛细胞形成突触、中枢突组成听神经;Ⅱ型细胞为假单极神经元,与外毛细胞形成突触。由于小鼠在生后很短时间范围内(7～10 d)耳蜗就发生骨化,并且Ⅰ型SGN细胞在生后一周内细胞髓鞘形成并开始分化出Ⅱ型细胞[1],本试验采用骨性耳蜗相对较软较薄的新生1～6 d的小鼠进行试验,利于耳蜗的解剖、螺旋神经节细胞的机械分离和酶解,以及全细胞膜片钳高阻封接的形成。

为了证实酶解神经细胞的性质,本研究采用了免疫荧光细胞化学的方法。神经微丝蛋白(NFP)是神经细胞骨架中的重要组成成分,存在于SGN的细胞胞体和突起中,分为3个亚单位,分别为68 000、160 000和 200 000[2],本实验中仅采用了200 000亚单位抗体作为一抗获得成功染色,证实实验细胞为SGN细胞。

本试验在急性分离的SGN细胞上记录到瞬时外向钾电流成分,通道在-60 mV左右开始激活,并对4-AP敏感,具有典型瞬时外向钾通道的特性。A型钾通道以瞬时出现、快速激活、快速失活为特点,故又称为瞬时外向钾电流(Ito)通道。它是在动作电位早期或细胞去极化早期出现的一种外向钾电流,该电流的大小对动作电位的形态和时程有较大的影响。SGN的动作电位有一超极化时相,当细胞膜再次去极化而兴奋时,A型钾通道被激活,以延迟去极化达阈电位的时间,即A型钾通道可以控制SGN的发放频率。另外A型钾电流(IA)在听觉形成中的作用,可能还与其快速失活特性有关,并可能通过短暂超极化细胞膜电位来调节细胞兴奋性。IA通过调节突触后膜(毛细胞与SGN传入纤维形成的突触)的兴奋性来调节毛细胞与SGN之间的突触效能,并通过减低峰电位的超极化后电位的衰减率来影响重复放电的频率,由此限制毛细胞受体电位的频率反应。并且它可能通过调节突触后电位和降低峰间期来确立放电频率的上限[2-4]。Jagger和Housley[5]在原位新生大鼠听神经元的组织切片膜片钳实验中,记录到IA,当Vh在-60 mV时,A型钾通道激活,在-55 mV时电流迅速上升,并且在-30～-40 mV时通道迅速失活,在静息膜电位下,A型钾通道构成了30%的细胞电导,IA在这种膜电位下构成了60%的去极化电流。应用4-AP抑制A型钾通道后,SGN的动作电位释放增加,适应性降低,证实其对动作电位复极化有影响。本实验用-100 mV预脉冲条件记录的电流减去-60 mV预脉冲引出的电流,分离出瞬时外向钾电流,并进行失活、恢复等特性的研究,结果与文献[5]研究相似,表明啮齿类动物的IA生理特性比较相似。本研究在出生1～6 d的小鼠SGN细胞中记录到IA,表明出生后A型钾离子通道已经基本发育成熟,至于其通道蛋白的表达可能主要为编码KV 3.4和KV4亚单位基因家族所控制[6]。

Jagger和Housley[5]认为A型钾通道可能主要集中在胞体和突触近端,而Szabo等[7]的研究表明,抑制IA对细胞放电特征中的快速失活特性没有影响,因此认为A型钾通道存在于SGN突触末端。由于急性分离SGN细胞的过程破坏了较多的神经突起,而使其较培养的SGN细胞IA的表达少[7-8]。本研究中IA在急性分离细胞中的出现可能与某些时候细胞酶解后细胞状态好、细胞突起保存较好,细胞本身的通道特性得到充分的表达有关。而IA的出现与神经元细胞在耳蜗的位置、细胞的大小、小鼠的天龄无关。可以认为体外急性酶解SGN细胞本身应具有A型钾通道,但是通道的表达要求较高,一旦外界环境,诸如温度、湿度、细胞外液和电极内液的 pH值、蛋白酶及终止液的浓度和终止时间的细微变化均可导致A型钾通道的不表达。这说明体外急性分离SGN细胞的实验技术需要进一步严格控制,而SGN的A型钾通道存在的位置以及在听觉传导过程中的作用还有待进一步研究和探讨。

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