单细胞凝胶电泳技术在环境毒理学实验教学中的应用

汪承润，王臣，姜传军，王昊，程涛，陈敬宇，胡玲玲，陈芬芬

（淮南师范学院 生命科学系，安徽 淮南 232001）

单细胞凝胶电泳技术在环境毒理学实验教学中的应用

汪承润，王臣，姜传军，王昊，程涛，陈敬宇，胡玲玲，陈芬芬

（淮南师范学院 生命科学系，安徽 淮南 232001）

介绍了植物细胞核DNA损伤的单细胞凝胶电泳的检测方法，依次包括载玻片的预处理和编号、细胞核的分离、包埋、解旋、电泳、中和、脱水、染色、摄像及其结果的软件分析等过程。并应用该方法检测了暴露于镉离子污染后的蚕豆幼苗叶片组织细胞核的DNA损伤程度。结果表明，该方法简单、易行，适合在环境毒理学的实验教学和科研中推广和应用。

单细胞凝胶电泳（SCGE）；环境毒理学；DNA损伤；遗传毒性；实验教学

1984年，Ostling等[1]首次提出了单细胞凝胶电泳(single cell gel electrophoresis，SCGE)技术，并利用该技术在中性条件下检测γ射线引起的DNA双链断裂。因其细胞拖尾形状颇似彗星，又称彗星试验(Comet Assay)。1988年，Singh等[2]在此基础上加以改进并建立了碱性单细胞凝胶电泳技术，不仅可以检测DNA单、双链断裂，还可用来检测碱性不稳定位点、DNA交联和不完全切除修复位点等，因此大大提高了SCGE检测的敏感性。这是一种测定和研究单个细胞DNA链断裂的新技术，与传统的DNA损伤检测方法相比，具有简便、快速、灵敏、样品量少、无需放射性标记等优点，已广泛，应用于人和动物细胞核DNA损伤和修复的研究[3-9]。虽经多次改良，但最常用的还是碱性SCGE方法。近年来，SCGE技术也逐步推广到真核单细胞微生物和植物细胞核DNA损伤的研究[10-15]。然而，由于植物细胞的特殊性和细胞核取材方法的限制，国内学者在该方面开展的研究工作报道较少。深感遗憾的是，多数毒理学实验教材只介绍以动物组织细胞或培养的动物或人体单细胞为研究对象的SCGE方法，而关于植物细胞SCGE实验方法的详细介绍未见报道。现将本课题组在教学和科研过程中改进的SCGE操作方法和注意事项介绍如下，供同行借鉴和参考。

1、植物组织细胞核SCGE操作流程

1.1 载玻片的预处理

在100 mL烧杯中配制适量1%（m/v）正常熔点琼脂糖(100 mL比较适宜)，加热完全溶解后置于50-60℃水浴锅中恒温保存。手持预冷后的载玻片的磨砂端，将载玻片立即浸没其中（非磨砂载玻片浸没于液面下部分约占玻片长度2/3左右），轻轻摆动玻片，2-3秒钟后取出玻片，垂直放置 （如图1-2所示），室温干燥过夜。

图1

图2

图3

1.2 载玻片的编号

由于碱性电泳液腐蚀性极高（pH＞13），用记号笔等工具标记组别又极易脱落。本课题组成员研究发现，若用解剖针等锋利工具在玻片的磨砂端或非磨砂玻片的手持端刻下处理组组别，如A-1，A-2…（如图3所示），则可彻底解决电泳过程中标记脱落的问题。

1.3 细胞核的分离

取新鲜叶片，立即平铺于塑料培养皿中（冰盒内），在叶片上滴加 1ml预冷的细胞核提取液（50mM Tris-HCl，10mM Na2EDTA，100 mM NaCl，0.1%TritonX-100，pH 7.4）湿润叶片。在暗室内的红光或黄光下，用镊子夹住叶片的一侧边缘，用刀片沿同一方向轻轻切划叶片成细丝状 （如图4所示），再加入1-2ml核提取液，用刀片将叶片碎片集中于提取液中，轻轻晃动培养皿，以便细胞核脱落于液体中。若分离后的液体颜色较浅，则可继续切划第二个叶片。然后用孔径50μm的尼龙布过滤核提取液，在4℃和1000rpm条件下离心5 min，弃上清，加入100μL核提取液悬浮细胞核，冰盒内避光保存备用。

补充两个问题：（1）植物根尖分生组织细胞核也可应用上述方法进行分离；根尖若经冰冻保存，则可用玻璃棒轻轻挤压即可释放出细胞核，后续步骤同上。（2）野外采集的样品若需长时间的运输，则必须冰冻和避光保存。

图4

图5

图6

1.4 细胞核的包埋：

取上述细胞核悬液，按照1:3的比例与1.5% (m/v)低熔点琼脂糖(用去离子水配制)轻轻混匀（也可根据细胞核密度调整该比例），取100μL该混合液轻轻滴加于预处理后的载玻片上,覆以盖玻片，以便细胞核均匀分布（如图5所示）。然后将玻片排列于湿盒内（如图6所示），用黑色塑料袋包被，转移至4℃冰箱，静置10 min，以便细胞核与低熔点琼脂糖冷凝。冷凝后的胶板上可以再铺0.5%低熔点琼脂糖作为第二层胶，也可以省略，不影响实验结果。

1.5 解旋与电泳：

将上述冷凝后的胶板去掉盖玻片，放置于水平电泳槽，含细胞核的一端朝向正极（如图7所示），在新配制的 4℃预冷的碱性电泳液（200mM Na2EDTA、10M NaOH，pH＞13）中浸没20 min左右，促使DNA充分解旋（此过程也具有加速RNA降解的作用）。在细胞核中，DNA附着于核基质上，在强碱性溶液作用下，超螺旋DNA结构解旋变为松弛状,断链和碱性易变性区段则变成断片，并暴露出负电荷基团。在电场力作用下，松动的DNA链以及断片向阳极迁移，从而形成外观类似彗星的拖尾。一般来说，DNA断片愈多，彗尾就愈长，核DNA的损坏程度就愈大。

解旋结束后，通过调节电泳液液面高度控制电泳条件（25V，300mA）。通过预实验，摸索空白对照组细胞核彗尾长度较小，而污染物处理组彗尾长度（可能）发生变化的电泳时间，为后续实验提供实验参数。

图7

图8

1.6 胶板的中和与染色

电泳结束，将胶板转移并排列于塑料盘或相应容器内（如图8所示），添加中和液（0.4M Tris-HCl, pH 7.5），浸没胶板。15 min后小心倾除中和液，代之以无水乙醇浸没胶板。10-15min后回收乙醇，取出胶板，室温下晾干。干燥后的胶板可在4℃环境下保存数月。染色前将胶板浸没于去离子水4-5分钟，取出后倾斜胶板，并用吸水纸小心吸去残留水迹。每张胶板滴加20μL适宜浓度的荧光染色剂(吖啶橙、溴化乙锭（EB）、碘化丙啶等)，其中EB浓度稀释至0.1%（m/v）以下，颜色呈微红色即可。用干净载波片轻轻推平荧光染色剂，使之均匀分布，避光染色5分钟后，手持胶板磨砂端，将胶板另端浸没于盛有去离子水的烧杯中，轻轻摆动数秒，洗涤残留染色液，再用吸水纸小心吸去残留水迹，加盖玻片，即可在荧光显微镜下观察并拍摄彗星细胞图片。上述第3-5步骤均要求在红光或黄光下操作完成。

1.7 图像的采集与分析

将带有盖玻片的胶板固定于载物台上,选择绿光激发波长590 nm激发视野,应用10×目镜和10×物镜,将细胞核放大100倍即可观察到清晰图像（也可增加放大倍数）。通常每个剂量组至少具备3个平行，每个平行2张玻片，每张玻片至少随机观察和拍摄25个细胞核。若样品中细胞核密度过低，或处理过程中细胞核裂解过度、胶脱落等均可导致可观察到的细胞核数量不足，需改进和重复实验。

彗星图像分析方法一般包括:（1）目镜测微尺测量法；（2）两脚规测量法；（3）图像分析软件(如Lucia、Auto Gentox、CometScore等分析软件)分析法。每个细胞核DNA损伤的测定指标一般包括：（1）尾长（Tai length）；(2）尾部DNA含量（Tai DNA %）；（3）尾矩(Tail moment)，即尾长与尾部DNA百分含量的乘积。有时还包括核直径、尾部光密度、总光密度和彗星总长度、尾惯量等指标，通常选择尾长和尾矩作为分析指标。同时尚需测定DNA拖尾率，即彗星细胞随机出现的频率（%）。

2、在实验教学中的应用

2.1 受试植物幼苗的培养与染毒处理

蚕豆种子（Vicia faba L.）为淮南当地习见品种（青皮豆）。种子用0.1%(m/v)次氯酸钠溶液浸没10min后，自来水充分漂洗，室温下浸泡24h后再转移至23°C培养箱内催芽，待根尖延伸至2cm左右时开始实验。筛选根尖长短基本一致的幼苗，转移至盛有Hoagland营养液[16]的水槽中悬浮培养，每个水槽培养10个幼苗，1天后分别更换成用该营养液配制的 Cd2+梯度溶液 （0、4、8、12 μM，pH 5.3?5.5）。水槽放置于光照培养箱内，培养条件为：白天15h，23°C，光照强度200 μmol m-2sec-1；夜晚9h，19°C，相对湿度均在75-80%之间。每天上、下午分别曝气4h，两天更换一次染毒溶液，6天后取叶片或根尖分离细胞核。

2.2 SCGE过程

载玻片的预处理、细胞核的分离、包埋、解旋、电泳等过程同上所述。

2.3 SCGE结果的分析方法

染色后的胶板在荧光显微镜下放大100倍观察并拍摄图片，结果如图9所示。本课题组一直应用CometScore分析软件分析SCGE电泳图片，方法和步骤如下：首先应用Photoshop软件从“模式”中将原图片的彩色转换为“灰度”，文件以BMP和OS/2格式保存备用。再通过CometScore软件打开并分析上述图片，得到一系列关于Tai length、Tai DNA、Tail moment等数值。最后应用SPSS统计软件进行统计分析（分析过程从略）。

本实验的分析结果表明，梯度Cd2+溶液诱导了蚕豆幼苗叶片组织细胞核DNA的损伤，并且呈现一定的剂量-效应关系（r2=0.805，p＜0.05）。

由此可见，应用上述实验方法即可容易检测到环境污染物作用下的植物组织细胞核的DNA损伤程度，与对照组比较即可初步诊断Cd2+对植物细胞核的遗传毒性的大小。通过上述实验操作过程的训练，不仅要让学生掌握植物细胞核SCGE的实验技能，而且要引导学生把这种方法应用于环境污染物的生态毒性的诊断与评价。

图9 蚕豆叶片组织细胞核的单细胞凝胶电泳图片（100×）

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[2]Singh NP，McCoy MT，Tice RR，et al.A simple technique for quantization of low levels of DNA damage in individual cells [J].Exp Cell Res，1988，175:184-191

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G642.423

A

1009-9530（2010）05-0084-03

2010-07-10

国家自然科学基金项目（20877032）；污染控制与资源化研究国家重点实验室开放基金项目（PCRRF08011）

汪承润(1966-)，男，安徽金寨人，淮南师范学院生命科学系副教授，博士，主要从事环境毒理学研究。