褪黑素、谷胱甘肽对猪精液冷冻保存效果的影响

李博玲，马恒东，王 贞

（四川农业大学动物科技学院，四川 雅安 625014）

本试验旨在研究褪黑素、谷胱甘肽两种抗氧化剂对精子冷冻的保护效应。通过对冷冻过程中活性氧（ROS）的检测以及冻后精子活率、活力、顶体完整性、线粒体活性的检测，筛选出较佳的抗氧化剂添加搭配组合，为猪冻精技术的发展提供参考。

1 材料与方法

1.1 材料

1.1.1 试验对象 健康、性欲旺盛成年杜洛克公猪，2008年10月至2009年4月 ，共采精13次。

1.1.2 试剂及耗材 主要试剂：褪黑素（MLT）、碘化炳碇（PI）、罗丹明 123，均为 Sigma公司产品；谷胱甘肽（GSH）、ROS初级荧光检测试剂盒购自成都溶海生物技术有限公司；甘油为Amresco公司产品；乳糖购自成都科龙化工试剂厂。

主要耗材：低温温度计为北京市宇时技术开发公司生产；倒置荧光显微镜为尼康公司生产；电子天平为沈阳龙腾电子有限公司生产；全自动酶标仪为Thermo公司生产；0.5mL冷冻细管为沈阳富士平工业有限公司生产。

1.1.3 冷冻稀释液和解冻液的配制 见表1。

表1 冷冻稀释液和解冻液的成分和剂量

1.2 试验设计 实验一：在稀释液中分别单独添加MLT、GSH，观察对精液冷冻保存的影响。

实验二：在稀释液中联合添加MLT、GSH，观察对精液冷冻保存的影响。

实验三：联合添加与单独添加两种抗氧化剂的比较。

1.3 方法

1.3.1 精液预处理及冷冻 用手握法采集中段精液浓稠部分，并立即用BTS等温稀释（1∶1），镜检活力在0.7以上的用保温瓶带回实验室。室温静置2h，用50mL 离心管分装、离心（2400×g，3min），去上清后加入乳糖-卵黄稀释Ⅰ液（1∶1），放入4℃冰箱缓慢降温、平衡约 2h，再加入乳糖-卵黄稀释Ⅱ液（1∶1）4℃平衡20min后，装管，液氮熏蒸（离液氮面 5cm，20min），投入液氮保存。

1.3.2 解冻后精液质量评定

（1）精子活力检测：精子活力状态利用BI-静态分析系统进行观察、录像，之后逐一评估。

（2）精子活率和线粒体活性检测：将解冻的精液用等温BTS液稀释，调整精子密度为3×106个/mL。先取等温的100μL HEPES/BSA缓冲液置于预温的1.5mL离心管中，然后加入10μL PI贮存液（取0.004g PI溶于2 mL PBS中，0.45 μm滤膜过滤后，-20℃避光贮存）和1μL罗丹明123贮存液（0.004g罗丹明123溶于2mL DMSO中，0.45μm有机相滤膜过滤后，避光保存），避光孵育10min，最后加入50μL精液，在37℃、黑暗潮湿环境下孵育30min。取10μL精子悬液于载玻片上，加盖玻片，荧光显微镜（200×）下观察。死精子在波长540～580nm紫外光激发下头部核区发出红色荧光，活精子和有活性线粒体的精子在波长511～534nm紫外光激发下头部不发光，而尾巴线粒体部分（中段）有亮绿色荧光。计算精子活率（活精子百分率）和有线粒体活性的精子百分率。

（3）顶体完整性检查：进行姬姆萨染色制片镜检。①制片：取10μL精液于载玻片一头，用一边缘整齐的玻片呈35°角将精液样品均匀拖布于载玻片上，自然风干，制成精液涂片。②固定：立即吸取10%福尔马林固定液1～2mL滴于自然风干的涂片上，固定15min，用水轻轻冲洗，洗去固定液，再自然风干。③染色：将姬姆萨染液滴于涂片上，染色1.5h，然后用水轻轻冲洗，晾干备检。

判定：顶体完整的精子头部外形正常，细胞膜和顶体完整着色均匀，顶脊、赤道段清晰。镜检计数200个精子，计算顶体完整精子的百分率。顶体完整率=顶体完整精子数/总精子数×100%

（4）ROS测定：利用ROS初级荧光测定试剂盒进行检测，按说明进行。结果判定：荧光单位（RFU）值越高，ROS含量越高。

1.4 数据处理 应用SPSS13.0 One-Way ANOVA软件进行数据分析。

2 结果与分析

2.1 单独添加MLT、GSH对精液冷冻保存的影响

2.1.1 MLT对解冻后精液质量的影响 由表2可以看出，添加0.125mg/mL、0.25mg/mL的褪黑素均能显著提高精子活率（P＜0.05），但两种浓度之间差异不显著。当加入0.25mg/mL褪黑素时，能显著提高精子活力（P＜0.05）；添加 0.125 mg/mL、0.25 mg/mL、0.5 mg/mL褪黑素均能显著提高冻后精子的顶体完整性（P＜0.05），其中以 0.25 mg/mL 的效果最佳（P＜0.05）；加入0.25 mg/mL褪黑素能显著提高冻后线粒体活性（P＜0.05）。说明褪黑素对顶体的保护作用较好，同时也能改善活率、活力以及线粒体活性。添加0.125mg/mL、0.25mg/mL的褪黑素，解冻后精子中的ROS含量下降，较对照组差异显著（P＜0.05），且添加0.25mg/mL的效果最佳（P＜0.05）。

表2 添加不同浓度的MLT对解冻后精子质量的影响

2.1.2 GSH对解冻后精液质量的影响 由表3可以看出，添加5mmol/L的GSH能极显著提高精子冻后活率、活力、线粒体活性（P＜0.01）；添加 1mmol/L、5mmol/L的GSH均能显著提高冻后精子的顶体完整性（P＜0.05），但两浓度之间差异不显著；添加GSH能显著降低冻后精子内ROS的含量。当加入10mmol/L GSH时，精子质量指标有所下降，说明GSH添加不能过量。

表3 添加不同浓度的GSH对解冻后精子质量的影响

2.2 MLT与GSH联合添加对解冻后精液质量的影响 多重比较结果表明，对于活率，M1G1、M1G2显著优于 M2G1，M2G2显著优于 M2G1（P＜0.05），M1G1、M1G2显著优于M2G2（P＜0.05）；对于活力，M1G1显著优于M2G1和M2G2，M1G2显著优于M2G1（P＜0.05）；对于顶体完整率和线粒体活性，各组之间差异显著，M1G1显著优于其他各组（P＜0.05）。总的来说，M1G1为联合添加最佳组合。

表4 MLT与GSH交互作用的组内比较

2.3 单独添加与联合添加抗氧化剂的比较 由表5可以看出，联合添加MLT与GSH较单独添加，其精子活率、活力、顶体完整性有显著提高（P＜0.05）；线粒体活性无显著差异；单独添加与联合添加MLT、GSH均能显著降低ROS含量（P＜0.05）。联合添加与单独添加的效果差异显著（P＜0.05），说明MLT与GSH之间存在显著的交互效应。

表5 单独添加与联合添加的比较

3 分析

MLT在本次试验中是第一次用于猪精液的冷冻保存。商学军等（2004）曾在精子模型中加入MLT共同孵育，观察其对线粒体功能的保护作用，结果显示MLT通过清除ROS，对精子线粒体具有重要的保护作用。本试验在冷冻稀释液中加入MLT，结果发现加入0.25mg/mL时，精子活率、活力、线粒体活性、顶体完整性都有显著提高（P＜0.05），且解冻后精子ROS含量显著下降（P＜0.05）。GSH是一种重要的抗氧化剂，其本身易受某些物质氧化，所以它在体内能够保护许多蛋白质和酶等分子中的巯基不被自由基等有害物质氧化。GSH能直接与过氧化氢等氧化剂结合，生成水和氧化型谷胱甘肽。本试验在冷冻稀释液中加入5mmol/L的GSH，结果显著提高了冻后精子的活率、活力及线粒体活性（P＜0.05）。

4 结论

褪黑素与谷胱甘肽具有显著的交互效应，褪黑素的存在提高了谷胱甘肽的抗氧化效率，因此，只有将两种抗氧化剂同时用于猪精液冷冻保存，才能更好地保护猪精子免受抗氧化损伤，达到提高解冻后精子质量的目的。

[1]Guthriee H D，Welch G R，LONG J A.Mitochondrial function and reactive oxygen species action in relation to boar motility[J].Theriogenology，2008，70：1209-1215.

[2]Petrunkina A M，Volker G，Weitze K F，et al.Detection of cooling-induced membrane changes in the response of boar sperm to capacitating conditions[J].Theriogenology，2005，63：2278-2299.

[3]Bailey J L，Bilodeau J F，Cormier N.Semen cryopr-eservation indomestic animals： adamaging and capacitating phenomenon[J].Androl，2000，21：1-7.

[4]任俊玲.冷冻稀释液中添加抗氧化剂对猪精液冷冻保存效果的影响[D].四川农业大学硕士学位论文，2007.

[5]商学军，黄宇烽，叶章群，等.褪黑素在活性氧致精子线粒体功能损伤中的保护作用 [J].中华男科学杂志，2004，10（8）：604-607.

[6]马忠兰.不同稀释液对猪精液保存效果的研究[J].黑龙江畜牧兽医，2004，（4）：31-32.

[7]董 伟.动物繁殖学[M].北京：农业出版社，1998：146.

[8]Reiter R J，Tan D X，Burkhardt S.Reactive oxygen and nitrogen species and cellular and organismal decline：amelioration with melatonin[J].Mech Ageing Dev.，2002，123（8）：1007-1019.

[9]Miguel M，Manuel M，Germaine E，et al.Melatonin but not vitamins C and E maintains glutathione hom-eostasis in t-butyl hydroperoxide-induced mitochond-rial oxidative stress[J].FASEB，2000，14：1677-1679.

[10] Gadea J， Elena S， Antonio M， et al. Decrease inglutathione content in boar sperm aftercryopreservation. Effect of the addition of reducedglutathione to the freezing and thawing extenders [J].Theriogenology，2004，62：690-701.