失眠大鼠5-HT、5-HIAA、NE的针刺时效研究

兰 妮 赵仓焕 徐拥建

（柳州市柳铁中心医院·545007）

与药物治病一样，针灸是一种重复使用的治疗方法。对于针灸治疗疾病的间隔时间，目前临床上大多数医生是依靠各自的经验，每天治疗1 次、2 次或隔日1 次，这是否为最佳的治疗间隔时间，能否取得最佳的治疗效果，目前还缺乏科学的根据。以往的研究证明了电针对PCPA 致失眠大鼠镇静催眠时可明显升高5-HT、5-HIAA 含量，降低NE 含量[1]。为了探讨电针治疗失眠症的最佳间隔时间及其机理,本研究通过检测PCPA 致失眠大鼠单次电针后下丘脑5-HT、5-HIAA 及NE的含量，观察电针后效应随时间延续的变化，为临床上选择合适治疗间隔时间提供一定实验依据。

1 材料与方法

1.1 实验动物

SPF 级健康雌性Wistar 大鼠，体重180～220g。由广州中医药大学动物房提供，生产许可证号：SCXK（粤）2008-0020，NO：0055714。

1.2 动物分组及处理

将合格的96 只大鼠随机分为电针组、模型组、对照组三大组，每组32 只动物。每组又根据电针后处理时间的不同分为3h 组、6h 组、12h 组和24h 组4 小组，其中每小组各8 只。失眠动物造模方法：将PCPA(45mg/100g)用弱碱性生理盐水(pH7.0～8.0)配置成混悬液，按1ml/100g 用量腹腔注射，1次/日，连续注射2日。

(1)电针组：于实验前连续两天腹腔注射PCPA 制备失眠动物模型，实验当天予电针治疗1 次，在电针后对应时间处死大鼠取脑组织测定指标。

(2)模型组：同电针组造模，于实验当天与电针组同方法固定20min，在固定后对应3h、6h、12h、24h 时处死大鼠取标本。

(3)对照组：不造模，于实验前连续两天腹腔注射同PCPA 用量体积的弱碱性生理盐水，其他处理同模型组。

1.3 电针方法

(1)取穴：穴位的定位参照《大鼠穴位图谱的研制》（华兴邦1991年发表于《实验动物与动物实验》）。神门穴：大鼠前肢内侧腕部横纹尺骨边缘。三阴交穴：大鼠后肢内踝尖直上10mm。

(2)电针操作：取0.35mm×25mm 无菌针灸针直刺双侧神门、三阴交穴3～5mm，连接G6805-2 型电针治疗仪，选用连续波型，频率10Hz，电压6V，强度由小到大，以大鼠肢体出现抽动为度，留针20min。

1.4 取材

于电针结束后3h、6h、12h、24h 将对应各小组处死，在枕骨大孔处迅速剪断延髓，去颅骨，完全暴露脑组织，取出脑组织，在冰冷平皿上去大脑、小脑，分离出下丘脑后在冰冷生理盐水中洗去血液称重。

1.5 大鼠下丘脑5-HT、5-HIAA、NE 的测定

参照文献[2]采用溶剂提取法提取标本中5-HT、5-HIAA、NE，运用荧光分光光度计检测其含量。

1.6 统计学处理方法

2 实验结果与分析

2.1 失眠大鼠模型复制及电针镇静催眠作用

本研究中正常大鼠在连续2d 腹腔注射PCPA 后，睡眠-觉醒的昼夜节律消失，说明模型复制成功。行为学表现为大鼠正常昼夜节律消失，活动明显频繁，白天也活动不停，兴奋性增高，攻击性增强。经过电针治疗后大鼠的睡眠-觉醒节律开始恢复，白天活动少，安静、蜷卧、不易被外界惊醒，提示电针治疗发挥了镇静催眠作用。

2.2 失眠大鼠单次电针后下丘脑5-HT、5-HIAA 及NE 的含量变化，详见表1-表3。

表1 电针对PCPA 致失眠大鼠下丘脑5-HT 含量的影响(±S)

表1 电针对PCPA 致失眠大鼠下丘脑5-HT 含量的影响(±S)

注：与对照组比较，▲▲P<0.01；与模型组比较，★★P<0.01。

5-HT(ng/g)对照组 模型组 电针组3h 8 978.12±19.77 675.67±28.01 ▲▲ 795.72±33.59 ▲▲★★6h 8 915.52±31.58 623.79±30.28 ▲▲ 692.70±21.29 ▲▲★★12h 8 890.92±31.28 614.63±15.86 ▲▲ 672.22±12.76 ▲▲★★24h 8 970.48±48.59 643.57±20.94 ▲▲ 650.02±24.94 ▲▲组别 例数(n)

表2 电针对PCPA 致失眠大鼠下丘脑5-HIAA 含量的影响(±S)

表2 电针对PCPA 致失眠大鼠下丘脑5-HIAA 含量的影响(±S)

注：与对照组比较，▲▲P<0.01；与模型组比较，★★P<0.01。

5-HIAA(ng/g)对照组 模型组 电针组3h 8 399.42±18.08 258.46±14.08 ▲▲ 373.38±7.13 ▲▲★★6h 8 381.31±11.69 232.66±15.04 ▲▲ 323.01±17.72 ▲▲★★12h 8 356.43±11.14 229.85±10.30 ▲▲ 285.04±13.62 ▲▲★★24h 8 393.81±22.86 248.60±18.47 ▲▲ 259.33±14.17 ▲▲组别 例数(n)

表3 电针对PCPA 致失眠大鼠下丘脑NE 含量的影响(±S)

表3 电针对PCPA 致失眠大鼠下丘脑NE 含量的影响(±S)

注：与对照组比较，▲▲P<0.01；与模型组比较，★★P<0.01。

NE(ng/g)对照组 模型组 电针组3h 8 508.41±8.29 655.43±13.47 ▲▲ 548.46±23.57 ▲▲★★6h 8 534.86±18.00 631.93±14.24 ▲▲ 570.61±18.17 ▲▲★★12h 8 555.44±24.83 644.01±38.69 ▲▲ 608.56±14.48 ▲▲★★24h 8 511.32±9.22 647.62±14.80 ▲▲ 634.67±13.46 ▲▲组别 例数(n)

由表1、表2、表3可见，模型组各时间组5-HT、5-HIAA含量均低于对应对照组、NE 含量均高于对应对照组，差异具有显著性(P<0.01)，说明腹腔注射PCPA 明显降低大鼠下丘脑的5-HT、5-HIAA 含量、升高大鼠下丘脑的NE 含量。电针后3h、6h、12h 电针组5-HT、5-HIAA 含量均明显高于对应模型组(P<0.01)、NE 含量明显低于对应模型组(P<0.01)，电针后24h 与模型组比较无显著差异(P>0.05)，说明电针治疗显著增加失眠大鼠下丘脑5-HT、5-HIAA 含量、降低NE 含量，且其效应可持续12h 以上。电针组各时间组5-HT、5-HIAA 含量均低于、NE含量均高于对应对照组，差异具有显著性(P<0.01)，说明单次电针不能使失眠大鼠的5-HT、5-HIAA、NE 含量完全恢复到正常水平。

3 讨论

睡眠-觉醒节律所涉及的神经生理过程非常复杂。许多学者发现[3,4]单胺类神经递质5-HT、5-HIAA、NE、DA 等参与睡眠机制的调节。5-HT 在睡眠的发生和维持中起着决定性作用。有研究发现[5]，给猫腹腔注射色氨酸羟化酶抑制剂PCPA能抑制5-HT 的生物合成，引起完全失眠。另有研究发现[6]，杏仁核注射5-HT 前体5-羟色氨酸(5-HTP)可使觉醒减少、慢波睡眠和快波睡眠增多、睡眠加深、入睡潜伏期缩短，提示杏仁核5-HT 有显著的促进睡眠作用。5-HIAA 是5-HT 的代谢终产物，其变化也间接反映5-HT 的变化。故本实验同时测定下丘脑中5-HT 及其代谢产物5-HIAA 的质量分数来研究电针对PCPA 大鼠的影响。NE 作为脑干网状结构上行激动系统的重要部分，主要与快速动眼相睡眠(REM)及觉醒的维持有关，并参与情感调节。有研究认为[7]，脑内NE 质量分数下降,可使其维持觉醒的功能降低，并减少对维持睡眠的5-HT 的抑制作用而改善睡眠。在本实验中，经电针神门、三阴交穴治疗后大鼠失眠行为得到明显改善，失眠大鼠下丘脑内降低的5-HT、5-HIAA 含量明显升高、升高的NE 含量明显降低，且3h、6h、12h 电针组这三项指标的含量与模型组比较差别均具有显著性，提示电针可能是通过增加其脑内5-HT 合成与代谢、降低NE 质量分数，恢复5-HT 通路与NE 通路之间的相互制约和平衡，进而恢复正常的睡眠-觉醒节律，达到治疗失眠的目的。

时间因素是影响针灸疗效的一个重要方面。针灸效应的发生发展与时间的关系，即为针灸作用的时间效应[8]，指的是在对穴位进行针灸刺激后，其效应的显现有一个规律，即先经过一段长短不一的潜伏期，然后针效才迅速上升，在高水平维持一段时间后，便逐渐下降回落至针前的水平。针刺作用的时效关系，包括针刺的最佳诱导期、针刺作用的半衰期、针刺作用的残效期[9]。这种时效关系说明针灸效应的作用时间是有限度的，这就提示在临床实践中，要想提高针灸的治疗效果，就要注重针刺的最佳诱导期（最佳留针时间）以及针刺治疗的间隔时间，以便针刺效应有效蓄积起来，达到治愈疾病的目的。另有研究表明，针灸治疗慢性失眠量效性非常重要，特别是针灸治疗初期，只有量积累到一定程度，疗效才能显现。本研究结果显示单次电针并不能完全消除PCPA 的作用使失眠大鼠下丘脑内单胺类递质恢复到正常水平，这也提示了在临床上治疗失眠应注意针灸治疗量的积累，需要进行重复多次的针灸治疗。针灸治疗失眠症既要求量的积累又受相对时间较短的针效半衰期的限制，本研究结果显示电针对失眠大鼠下丘脑单胺类递质的效应持续12h 以上，故建议在针效完全消失前给予第2 次针灸以达更好的治疗效果。就本实验研究而言，电针治疗是在连续2d 腹腔注射PCPA 后达到完全失眠后进行的，正值失眠症状最明显的时候，从治疗失眠的量效积累和本研究显示的针效延续时间结果，建议在失眠症状明显期，为了提高和巩固电针疗效，临床上可适当间隔12h 左右给予第2 次电针治疗，即给予每日两次针灸治疗。

[1] 任莉.不同穴位处方电针的催眠作用及其机理研究[D].广州:暨南大学硕士学位论文,2006.

[2] 徐淑云,卞如濂,陈修.药理实验方法学第三版[M].北京:人民卫生出版社,2001:459-464.

[3] MALONEY K J,MA NVILLE L,JONES B E.Differential c-Fos expression in cholinergic,mono-aminergic,and GABA ergic cell groups of the pontom esencephalic tegmentum after paradoxical sleep deprivation and recovery[J].NeuroscI,1999,19(8):3057-3072.

[4] YOUNGBLOOD B D,SMAGIN G N,ELKINS P D.The effects of paradoxical sleep deprivation and valine on spatial learming and brain5-HT metabolism[J].Physiol Behav,1999,67(5):643-649.

[5] BORBELY A,NEUHAUSHU,TOBLER I.Effect of pchloropheny alanine and tryptophan on sleep,EEG and motor activity in therat[J].Behav Bra in Res,1981,2(1):1-22.

[6] 朱国庆.5-羟色胺和环磷酸腺苷对睡眠的影响[J].中国药理学通报,1999,49(2):135-140.

[7] 江帆.与睡眠相关的中枢单胺类递质[J].国外医学:精神病学分册,2001,28(1):55.

[8] 林文注,王佩.实验针灸学[M].上海:上海科学技术出版社,1999:116.

[9] 陈少宗.针刺作用时效关系研究的临床意义[J].针灸临床杂志,2008,24(6):1