水通道蛋白AQP9在帕金森病脑组织中的表达及作用

余玉银唐省三李方成汪 凌梁淑燕程 彦

1）广东同江医院神经外科 佛山 528300 2）广东食品药品职业学院护理学院 广州 510520 3）中山大学第二附属医院神经外科 广州 510120 4）广东佛山市顺德区大良医院 佛山 528300

帕金森病（Parkinson’s disease，PD）是最常见的运动障碍且与老化相关的神经退行性疾病之一。约2%的60岁以上老人罹患此病，主要临床表现是运动障碍（运动迟缓、震颤、姿势不稳、僵直）与非运动相关症状（嗅觉缺失、自主反应失调、认知缺陷、抑郁和睡眠障碍）。有研究显示，水通道蛋白（Aquaporin，AQP）9即AQP9参与了机体能量代谢及水电解质调节［1-2］。目前，鲜有文献报道帕金森病脑组织中AQP9的表达变化以及其对帕金森病的影响。因此，本研究旨在通过建立大鼠帕金森病模型，运用RT-PCR技术和免疫组织化学（immunohistochemistry，IH）等实验方法，研究帕金森病大鼠脑组织中AQP9表达的变化情况，分析帕金森病不同阶段中AQP9表达所发挥的作用，探索新的临床治疗帕金森病的理论基础。

1 材料与方法

1.1 实验动物及分组 选取成年广东省医学实验动物中心提供的64只Wistar大鼠，雄性，体质量200～250g。动物分为正常组（n＝10）、假手术组（n＝27）和帕金森病组（n＝27）。假手术组和帕金森病组分别于术后1、2、3、4、5、6、8、10和12周取材。每一时间点，分别用IH及RT-PCR法检测帕金森病组和假手术组大鼠3只。

1.2 PD大鼠模型制作及入选标准

1.2.1 PD大鼠模型制作：大鼠称重并记录后，向大鼠注射6%水合氯醛进行麻醉；将大鼠固定在立体定位仪上，经常规碘酒和酒精消毒后，取头部正中矢状位切开皮肤与皮下组织至颅骨。按照包新民等研究的大鼠脑图谱确定黑质及黑质纹状体通路注射坐标位点，将新鲜配制的6-OHDA溶液4μL（6-OHDA含量为12μg）通过微量注射器缓慢匀速地注射到大鼠脑内，退出微量注射器后立即缝合切口。动物苏醒后，予以食水，送回动物饲养室。假手术组大鼠除不注射药物6-OHDA外，其余操作同帕金森病组。

1.2.2 PD大鼠模型行为学检测：大鼠术后1周，在注射6-OHDA的大鼠腹腔内注射盐酸阿扑吗啡（5mL／kg），注射后5min后，观察大鼠向对侧旋转的情况并使用大鼠帕金森病模型旋转检测仪予以记录，连续记录60min，旋转标准为：大鼠向注射药物的对侧不改变方向地旋转360°为旋转1次。上述操作每周1次，连续检测12周。PD大鼠模型制作成功标准为：大鼠平均旋转次数≥7次／min。假手术组大鼠未出现明显的神经功能障碍。

1.3 实验方法

1.3.1 制作脑组织切片：麻醉受试大鼠，生理盐水心脏灌注后，断头取脑组织并立即进行冰冻切片，按照厚约10μm／片标准 连续切片，晾干后做常规HE和IHC染色。

1.3.2 IHC检测AQP9的表达变化：切片洗片后，按照SAP-9100（中杉金桥）免疫组化试剂盒的说明完成操作。使用水溶性封片剂进行封片，并在光学显微镜下进行观察及拍照。阴性对照组采用0.01mol／L PBS缓冲液代替一抗，其余步骤与实验组相同。

1.3.3 RT-PCR检测AQP9mRNA含量的变化：对实验大鼠进行麻醉，心脏灌注冰生理盐水后断头取脑，选取帕金森组大鼠50mg病灶周围脑组织，同时选取假手术组与正常组大鼠相应部位50mg脑组织。按照Trizol试剂说明书（Takara公司生产）提取各受试大鼠的脑组织RNA，用紫外分光光度仪进行检测。mRNA逆转录为cDNA依照杭州博日AMV逆转录试剂盒的操作说明进行。用AQP9（165bp）上游5′-gaaggacggtgccaagaag-3′，下游5′-gtgatgatcccgccaaaac-3′；B-actin（398bp）上 游5′-ctgccgcatcctcttcctc-3′，下 游5′-ctcctgcttg ctgatccacat-3′引物对AQP9及β-actin的cDNA进行扩增，PCR产物含量采用2%琼脂糖凝胶电泳法检测，其结果通过紫外分析仪进行观察并照相。

1.3.4 图像分析：在免光镜下分析疫组化结果，使用北航CM-2000B型生物医学图像分析系统对随机选取的同一部位切片10个不同视野进行自动分析，细胞平均灰度值表示其结果；RT-PCR结果采用Bandscan5.0分析软件进行密度分析，AQP9mRNA的表达水平计算公式为：AQP9mRNA含量＝AQP9光密度值／β-actin光密度值。

1.4 统计学方法 采用SPSS 19.0进行统计分析，计量资料以（±s）表示，两两比较采用独立样本t检验，计数资料以率（%）表示，采用χ2检验，P＜0.05表示差异具有统计学意义。

2 结果

2.1 脑组织病理变化 选取的脑组织切片经Nissl染色，帕金森病组成功模型鼠左侧黑质致密部（SNC）及中脑腹侧被盖区（VTA）区可见到神经元数目明显减少，颗粒密度减少，内氏体模糊，伴有少量反应性胶质细胞增生，损毁范围以注射点为中心向周边扩散，在靠近前囟后5.2mm的切片上显示SNC区损毁面积达1.87mm×0.26mm，占SNC总面积的94%，右侧SNC及VTA区神经元未见明显减少，颗粒密度分布正常，内氏体清晰。而正常组及假手术组双侧SNC及VTA区神经元数目未见异常。

2.2 AQP9在不同组别中表达比较 IHC结果显示，正常组双侧大脑皮质、下丘脑、海马、左侧黑质致密部（SNC）及中脑腹侧被盖区（VTA）区AQP9表达呈弱阳性，假手术组各时段与正常组基本一致，但帕金森病组AQP9表达则呈现动态性变化过程：术后1周，病灶侧大脑皮质、海马、左侧黑质致密部（SNC）及中脑腹侧被盖区（VTA）区、室管膜、脉络丛、下丘脑室旁核和视上核AQP9表达较假手术组强，差异存在显著性（P＜0.05）；术后2～5周，帕金森病组AQP9表达逐渐降低，至4周降至最低，均低于同一时点假手术组AQP9表达水平（P＜0.05），仅脉络丛可见较强表达；6周后双侧大脑AQP9广泛表达，AQP9表达在黑质致密部及中脑腹侧被盖区、大脑皮质、脉络膜、双侧室管膜、穹窿下器等脑室周围器官、背侧丘脑、海马、病灶中心区及周围组织、下丘脑室旁核、视上核等部位均可见，8周尤为明显，显著高于同一时点假手术组AQP9表达水平（P＜0.05）；随后AQP9表达量呈现下降趋势，但于12周时，其表达水平仍明显高于假手术组（P＜0.05），详见图1。

图1 帕金森病脑组织中AQP9的表达变化

2.3 各组AQP9mRNA含量变化 正常组、假手术组和帕金森病组大鼠病灶周围脑组织是本实验AQP9mRNA含量的检测对象。RT-PCR结果显示：假手术组AQP9mRNA含量与正常组比较，差异无显著性；帕金森病组AQP9mRNA的表达则呈现动态性变化过程：术后1周，帕金森病组大鼠脑组织AQP9mRNA含量已明显高于假手术组含量（P＜0.05）；随后，该组AQP9mRNA含量呈逐渐下降趋势，于4周时降至最低值，明显低于同一时点假手术组AQP9mRNA表达水平（P＜0.05）；之后，AQP9mRNA含量又逐渐升高，自术后5～12周各时段，AQP9mRNA含量均明显高于假手术组（P＜0.05），并于8周达到峰值，随后呈现下降趋势，但12周时，AQP9mRNA含量仍明显高于假手术组（P＜0.05），详见图2。

图2 帕金森病脑组织中AQP9mRNA的表达变化（RT-PCR）

3 讨论

水通道蛋白即水孔蛋白，是一组与水通透有关的细胞膜转运蛋白。自1988年发现第一个水通道蛋白后，从哺乳动物组织内相继分离克隆出至少13种AQP［3］。目前，在脑组织中发现6种AQP蛋白，它们分别是AQP1、3、4、5、8和9［4］。AQP9作为水通道蛋白一种特殊亚型，具有广泛通透性，既具有水通透性，还对多元醇、尿素、嘧嘌呤City、啶类、单羧基类等中性溶质以及类金属物质都具有很好的转运活性［5-6］。脂肪组织中最早发现AQP9的存在，随后在白细胞、肝脏、睾丸、脑和脾等组织中也有发现［7］。目前对AQP9在脑组织的认识尚处于起步阶段，鲜见相关报道。

学术界一直认为PD发病与环境因素密切相关，特别是环境中一些杀虫剂、除草剂以及铜、锰、铅等金属元素可能导致PD的发生。研究发现脑多巴胺神经元线粒体内膜上AQP9呈现阳性表达［8］，中毒的主要靶点在线粒体，AQP9在脑组织中不仅与维持水代谢平衡有关，而且在能量代谢方面发挥着重要作用［9］，因此推测AQP9可能与PD发病有一定的关联，但目前尚缺乏对两者相关性及作用机制的明确认识。

本实验使用大鼠脑图谱确定黑质及黑质纹状体通路注射位点坐标方法制造帕金森病模型。帕金森病组脑组织切片经Nissl染色，可见帕金森病组成功模型鼠左侧黑质致密部（SNC）与中脑腹侧被盖区（VTA）区神经元数目明显减少，颗粒密度减少，内氏体模糊，伴少量反应性胶质细胞增生，说明帕金森病动物模型制造成功。本研究发现，帕金森病组AQP9和AQP9mRNA的表达则呈一动态性变化过程：术后1周，AQP9强表达于病灶侧大脑皮质、海马、左侧黑质致密部（SNC）及中脑腹侧被盖区（VTA）区、脉络丛、室管膜、下丘脑视上核及室旁核（P＜0.05）；术后2～5周，AQP9表达呈现逐渐下降趋势，至4周时其值达到最低，均低于同一时点假手术组AQP9表达水平（P＜0.05），仅脉络丛可见较强表达；6周后双侧大脑广泛表达AQP9，8周尤为明显，显著高于同一时点假手术组AQP9表达水平（P＜0.05）；随后AQP9表达呈现减弱趋势，但于12周时，其表达水平仍明显高于假手术组（P＜0.05）。由此推测，此期高表达的AQP9，主要通过调节水电解质和能量代谢，从而在帕金森病发病机制中起重要作用。

综上所述，术后2周帕金森病组出现AQP9及其mRNA表达降低现象，在细胞间液急剧增加的情况下，通过延迟形成细胞内水肿，发挥保护胶质细胞的作用；随后，AQP9及其mRNA表达呈现上调趋势，提示可能与机体出现水电解质平衡和能量代谢失调有关。目前，医学界对帕金森病鼠脑AQP9研究还处于初始阶段，相关调控机制的研究还需要进一步探索。

［1］Rojek AM，Skow ronskiM T，Fuchtbauer EM，et al.Defective glycerol metabolism in aquaporin 9（AQP9）knockout mice［J］.Proc Natl Acad Sci USA，2007，104（9）：3 609-3 614.

［2］Badaut J，Brunet JF，Petit JM，et al.Induction of brain aquaporin 9（AQP9）in catecholam inergic neurons in diabetic rats［J］.Brain Res，2008，1 188：17-24.

［3］Magni F，Sarto C，Ticozzi D，et al.Proteomic knowledge of human aquaporins［J］.Proteomics，2006，6（20）：5 637-5 649.

［4］Badaut J，Lasbennes F，Magistretti PJ，et al.Aquaporins in brain：distribution，physiology，and pathophysiology［J］.J Cereb Blood Flow Metab，2002，22（4）：367-378.

［5］Badaut J，Brunet JF，Regli L.Aquaporins in the brain：from aqueduct to"multi-duct"［J］.Metab Brain Dis，2007，22（3-4）：251-263.

［6］Leung J，Pang A，Yuen WH，et al.Relationship of expression of aquaglyceropor in 9with arsenic uptake and sensitivity in leukem ia cells［J］.Blood，2007，109（2）：740-746.

［7］Elkjaer M，Vajda Z，Nejsum LN，et al.Immunolocalization of AQP9in liver，epididymis，testis，spleen，and brain［J］.Biochem Biophys Res Commun，2000，276（3）：1 118-1 128.

［8］Tait MJ，Saadoun S，Bell BA，et al.Water movements in the brain：role of aquaporins［J］.Trends Neurosci，2008，31（1）：37-43.

［9］Amiry-Moghaddam M，Lindland H，Zelenin S，et al.Brain mitochondria contain aquaporin water channels：evidence for the expression of a short AQP9isoform in the inner mitochondrial membrane［J］.FASEB J，2005，19（11）：1 459-1 467.