卵胞浆内单精子注射后多原核合子发生的相关研究进展

韩瑞刚，朱　亮

(解放军第306医院生殖医学中心，北京 100101)



卵胞浆内单精子注射后多原核合子发生的相关研究进展

韩瑞刚，朱亮

(解放军第306医院生殖医学中心，北京 100101)

[摘要]多原核合子是常规体外受精-胚胎移植过程中的正常现象，卵胞浆内单精子注射(ICSI)避免了多精子受精造成的多原核合子，但仍有可能出现多原核合子。ICSI后多原核合子出现主要是由于第二极体排出异常造成，卵母细胞质量、男方精液情况以及ICSI操作技术本身都是多原核合子形成的影响因素。该文针对ICSI后多原核合子的产生机制、影响因素、妊娠结局及相应处理措施进行综述。

[关键词]卵胞浆内单精子注射；多原核；极体；进展

多原核合子是常规体外受精-胚胎移植(in-vitro fertilization and embryo transfer，IVF-ET)过程中的正常现象，其发生率为 2%～10%[1]。卵胞浆内单精子注射(intracyto￣plasmic sperm in-jection，ICSI)多原核的发生率为3.7%，多见3原核(pronucleus PN)[2]。ICSI后4原核的受精卵极为罕见，张媛媛等于2012年研究发现ICSI后4PN形成率仅为0.2%。多原核合子的增加直接导致可利用的胚胎数减少，若误将多原核胚胎用来移植又可导致流产、多倍体畸形儿及葡萄胎的发生[3]。

1卵胞浆内单精子注射后发生多原核合子的机制

常规 IVF 中3原核发生最主要的原因是多精受精。而在ICSI过程中只有一个精子被注入卵细胞浆，排除了多精受精的可能。Rosenbusch[4]收集了一系列ICSI异常受精合子(3～5PN，1～2个polar body, PB)，合子在含鬼臼毒素和长春碱的培养液中过夜孵育，低渗及固定后吉姆萨染色进行核型分析。结果发现了ICSI后多原核存在多种形式，包括二倍体、亚三倍体、三倍体等。推测多原核合子可能有以下7种形式：①三倍体合子(n=69)，3PN，1PB(极体)。一般均为第2PB未排出。3PN中每个PN含有1套单倍体(n=23)，则DNA复制后，PN膜融合，会形成1个三倍体合子；②三倍体合子(n=69)，3PN，1PB。第2PB未排出，且2个雌原核染色单体分离不均，出现1个PN染色单体不足(n-α)，另一个PN染色单体增加(n+α)。文献报道所涉及的异常染色体一般在1～3条之间(α=1～3)。这样的合子均为三倍体；③亚三倍体合子(n=56～59)，3PN，2PB。第2PB排出不完全，一部分染色单体滞留在卵胞质中，形成一个额外的雌原核，合子为亚三倍体(n=56～59)。这类合子的PN大小相似或者为2大1小；④二倍体合子(n=46)，3PN，2PB。第2PB完全排出(n=23)，而剩余的卵子染色单体发生了分裂，形成2个雌原核，均为亚单倍体(n-α, α)。这种情况可能卵子本身为非整倍体；⑤三倍体合子(n=69)，4PN，1PB。第2PB未排出，而2个母本染色单体中的1个发生了分裂。即形成了3个雌原核(n, -α, α)；⑥亚三倍体合子(n=53～55)，4PN,2PB。第2PB排出不完全，而原本的卵原核也发生了异常分离，形成了共3个雌原核(n-α, α, n-b),第二PB(n=b)；⑦三倍体合子(n=69)，5PN，1PB。第2PB未排出，原本的第2PB和卵原核均发生分裂，形成4个亚单倍体的雌原核(n-α, α, n-b, b)。

就PN和PB数目而言，以上是ICSI后出现异常PN的大部分情况。由此可提出3种机制来解释ICSI多原核合子的起源：①第2PB整个未排出，造成一个额外的单倍体雌原核。这样的合子为三倍体合子；②第2PB不完全排出(母本染色体分离不彻底)，多余一个亚单倍体雌原核。这样的合子为亚三倍体；③第2PB排出，而原本的卵原核发生了分裂，形成2个亚单倍体雌原核。这样的合子为二倍体。3种机制均可发生，形成多原核不同倍性的合子。

2卵胞浆内单精子注射后多原核合子发生的相关因素

2.1卵母细胞因素

ICSI 周期中异常受精的发生与卵母细胞、精子及 ICSI 操作技术有关。在有活动精子及成熟的ICSI 操作技术情况下，卵母细胞质量是决定受精成败的最关键因素，任何影响卵母细胞质量的因素都会影响其受精情况[5]。赵志明等发现出现3PN合子的患者对Gn刺激反应高，认为3PN合子的产生可能与其对Gn刺激的高反应有关。这种高反应表现为对促排卵的敏感性强，即同样促排剂量，获得更多的卵母细胞。但这种高反应可能在某种程度上影响卵子的质量和内部结构，可导致卵母细胞代谢异常、三磷酸腺苷含量下降、转录异常、不同步的核/质成熟、微管混乱、卵原性多倍体形成。卵巢对Gn 刺激的反应高可能加重了卵母细胞这些异常的发生，最终导致异常受精的发生。

有学者认为[1]，多原核形成与卵母细胞纺锤体微管缺陷有关，如纺锤体不能结合到染色体着丝粒而导致染色体偏离赤道板，这些分离的染色体片段，被核膜包裹而独立形成原核。纺锤体极体微管组织中心的微核活性发生改变，可形成多极纺锤体，使染色体发生多极分离，最终导致多原核受精卵的产生。

也有研究 提示，大于38岁女性患者卵母细胞核非整倍体的发生率为38.3%，认为其与年龄相关[6]。女方年龄较大时， 细胞内积聚的过氧化物等对处于第1次减数分裂静止期的卵子破坏增加，引起卵子非整倍体的概率相应增加，多原核孕卵发生率增高。此外，多倍体卵母细胞或卵母细胞第1、第2次减数分裂错误都会造成多原核的发生。

2.2精子因素

ICSI周期不会发生多精受精，但有研究发现，对于严重少、弱精子症患者，二倍体精子发生率为2.2%，其二倍体发生率远高于正常精液精子[7]。因此，ICSI后二倍体精子可以多形成一个原核。Negri等[8]研究ICSI射精精子、新鲜附睾精子、冻融附睾精子或睾丸精子，发现3PN的发生在新鲜附睾精子最低，冻融附睾精子最高。赵志明研究发现精子来源(射精与附睾、睾丸相比)和精子质量(正常与差相比)对ICSI后3PN的产生及随后的妊娠率均无影响。 因此，精子因素对ICSI后多原核的发生还需进一步研究。

2.3卵胞浆内单精子注射操作技术本身因素

ICSI操作过程中可能损伤了赤道板区域，分裂中期的细胞受损；第1次减数分裂纺锤体再定位或者是显微注射中对卵母细胞骨架的破坏造成第2次减数裂纺锤体的错误定位[9]。这些都可能造成第2PB不排出。而这种染色体不平衡可能与显微注射的延迟有关。张文红等观察发现ICSI多原核胚胎停育率明显高于IVF多原核胚胎(39.3% vs 10.2%)，表明ICSI操作技术对卵母细胞可能产生机械损伤，产生机械损伤，使细胞骨架结构异常，导致染色体分裂紊乱，进一步影响胚胎继续分裂，致使发育停滞。此外，多原核胚胎自身基因的缺陷也是阻碍胚胎进一步发育的重要原因。

3卵胞浆内单精子注射后多原核合子发生与妊娠结局

张媛媛等研究认为，与对照组相比，ICSI 后多原核合子组优质胚胎率、种植率、临床妊娠率组间无统计学差异。这表明异常受精的发生并不代表较差的妊娠结局。但Figueira等报道[10]，当 3PN 率≤25% 时，妊娠结局不受影响，3PN率>25% 时，其结局将大大受损。

有研究用 FISH 技术检测ICSI 受精卵，36% 的3PN 受精卵实为二倍体受精卵，3PN 中 1 个原核为单倍体，而另外 2 个PN 的染色体加在一起为单倍体[11]。张文红等将 ICSI来源的2个4PN受精卵培养到囊胚阶段，对囊胚细胞进行DNA短串联重复序列基因座多态性分析，结果显示它们均为二倍体核型。有研究提出胚胎本身具有自我修复能力，在患者 ICSI后无2PN胚胎时，可考虑利用植入前遗传学诊断技术选择正常核型的 3PN 胚胎进行移植[12]。也有研究通过去除IVF来源3PN受精卵中一个原核并继续培养，从而获得正常人类胚胎干细胞[13]。

[参考文献]

[1]Kim Y J,Ku S Y,Jee B C,etal.Increased responsiveness may be associated with tripronuclear embryos in both conventional in vitro fertilization and intracytoplasmic sperm injection cycles using gonadotropin-releasing hormone agonist long protocols:a self-matched observational study[J].J Obstet Gynaecol Res,2011,37(1):37-44.

[2]Figueira R C,Setti A S,Braga D P,etal.Prognostic value of triploid zygotes on intracytoplasmic sperm injection outcomes[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(10):879-883.

[3]Weinerman R S,Fino M E,Kramer Y,etal.Phenotypic outcomes of tripronuclear (3PN) zygotes resulting from intracytoplasmic sperm injection (ICSI) vs. conventional insemination (INSEM) using time-lapse microscopy (TLM)[J].Fertil Steril,2011,96(3):S242.

[4]Rosenbusch B E.A preliminary concept,deduced from cytogenetic analyses,for explaining different types of multipronuclear oocytes obtained after intracytoplasmic sperm injection[J].Fertil Steril,2010,94(6):2479-2481.

[5]Miyara F,Aubriot F X,Glissant A,etal.Multiparameter analysis of human oocytes at metaphase II stage after IVF failure in non-male infertility[J].Hum Reprod,2003,18(7):1494-1503.

[6]Kurahashi H,Tsutsumi M,Nishiyama S,etal.Molecular basis of maternal age-related increase in oocyte aneuploidy[J].Congenit Anom (Kyoto),2012,52(1):8-15.

[7]Savage P,Sebire N,Dalton T,etal. Partial molar pregnancy after intracytoplasmic sperm injection occurring as a result of diploid sperm usage[J]. J Assist Reprod Genet,2013,30(6):761-764

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[9]Babayev S N,Park C W,Bukulmez O.Intracytoplasmic sperm injection indications: how rigorous?[J].Semin Reprod Med,2014,32(4):283-290.

[10]Figueira R C,Setti A S,Braga D P,etal.Prognostic value of triploid zygotes on intracytoplasmic sperm injection outcomes[J].J Assist Reprod Genet,2011,28(10):879-883.

[11]Reichman D E,Jackson K V,Racowsky C.Incidence and development of zygotes exhibiting abnormal pronuclear disposition after identification of two pronuclei at the fertilization check[J].Fertil Steril,2010,94(3):965-970.

[12]Grau N,Escrich L,Martín J,etal. Self-correction in tripronucleated human embryos[J].Fertil Steril,2011,96(4): 951-956

[13]Jiang C Y,Cai L B,Huang B X,etal.Normal human embryonic stem cell lines were derived from microsurgical enucleated tripronuclear zygotes[J].J Cell Biochem,2013,114(9):2016-2023.

[专业责任编辑：吕淑兰]

Related study progression of multipronuclear zygotes after intracytoplasmic sperm injection

HAN Rui-gang, ZHU Liang

(Assisted Reproductive Medical Center, the 306thHospital of PLA, Beijing 100101, China)

[Key words]intracytoplasmic sperm injection (ICSI); multipronuclear; polar body; progression

[Abstract]Multipronuclear zygotes are common after conventional in-vitro fertilization and embryo transfer (IVF-ET). There are still some multipronuclear zygotes after intracytoplasmic sperm injection (ICSI), although this technique can avoid polyspermous fertilization. The cause might be the abnormal extrusion of the second polar body. The related influencing factors on multipronuclear zygotes after ICSI include quality of oocytes and sperms, as well as ICSI operation technique itself. This article summarized the mechanism, influencing factors, pregnancy outcomes and corresponding measures of multipronuclear zygotes after ICSI.

[收稿日期]2015-01-06

[作者简介]韩瑞刚(1975-)，男，主管技师，主要从事辅助生殖实验室工作。

[通讯作者]朱亮，副主任医师。

doi:10.3969/j.issn.1673-5293.2016.05.040

[中图分类号]R711.6

[文献标识码]A

[文章编号]1673-5293(2016)05-0667-03

【生殖健康研究】