足 细 胞 研 究 进 展

足细胞是位于肾小球基膜外表面的终末分化细胞，在保持肾小球过滤屏障的结构和功能方面起关键作用。足细胞基因表达谱为足细胞研究提供了重要的基础数据支撑，分析比较正常和疾病状态下足细胞mRNA表达谱可提示参与疾病发生和进展的基因。研究人员通过计算机学习分析、分离足细胞或进行单细胞测序，建立了足细胞特异性基因表达谱，为研究生理及病理状态下足细胞功能奠定了分子基础。

1998年，研究者利用定位克隆技术，发现足细胞裂孔隔膜相关分子NPHS1基因突变可导致先天性芬兰型肾病综合征，研究者开始意识到足细胞损伤可能是导致蛋白尿的始动环节。近年来，通过对先天性和遗传性肾病综合征家系研究，先后确定四十多个足细胞分子基因突变，极大加深了对足细胞在肾小球功能中重要作用的认识。同时，非编码RNA、免疫因素和肾小球固有细胞相互影响在足细胞功能和损伤中的作用被发现和研究。

足细胞相关疾病基因组学研究

通过对先天性和遗传性肾病综合征家系研究，肾小球滤过屏障功能障碍或致蛋白尿相关的基因不断被发现，目前已证实四十多个导致遗传性肾病综合征的单基因突变[1]。这些基因编码蛋白大都位于足细胞上(图1)，参与足细胞信号传导，如二酰甘油激酶(ethylene diamine tetraacetic acid，DGKE)基因和磷脂酶Cε1(PLCE1)，稳定骨架结构等功能，从遗传学角度证实了足细胞在滤过屏障中的重要作用。斑马鱼模型在上述突变基因功能筛选中发挥了重要作用[2-5]。

图1 遗传性肾病综合征的突变基因及其致病通路

通过全基因组关联研究(genome-wide association study，GWAS)相继发现APOL1和MYH9基因单核苷酸多态性(SNPs)与非洲裔美国人的局灶性节段性肾小球硬化(FSGS)的高发病率有关[6]。Xie等[7]通过对FSGS 家系进行连锁分析，发现染色体14q32倒置形成蛋白2(inverted formin 2，INF2)2号外显子存在碱基变异m.253C>G，其所编码的85位氨基酸由丝氨酸改变为色氨酸(p.S85W)；中国家族性FSGS中INF2突变的总体频率约3.6%，远远低于欧洲FSGS家族的频率。Gbadegesin等[8]应用外显子芯片分析了南亚214例激素敏感性肾病综合征(SSNS)儿童患者的外显子组，发现位于6号染色体的主要组织相容性复合物(MHC)II类基因HLA-DQA1和HLA-DQB1区域的SNPs，与激素敏感性肾病综合征关联，提示免疫因素参与激素敏感性肾病综合征发病机制。

HLA基因异常还与膜性肾病(MN)发病机制相关，Stanescu等[9]对556例特发性膜性肾病(IMV)的白种人进行了全基因组关联研究，发现位于染色体2q24编码M型磷脂酶A2受体(PLA2R)基因(SNP rs4664308)和6p21编码HLA-DQA1基因(SNP rs2187668)的SNPs位点，与IMN有密切关联。同时携带这两个风险等位基因者，IMN的可能性高达78.5%，推测携带HLA-DQA1 SNP rs2187668等位基因可能促进机体针对靶抗原，如PLA2R1突变体的自身免疫应答。

HLA等位基因HLA-DRB1*15∶ 01 和 HLA-DRB3*02∶ 02与中国人群PLA2R 相关MN显著相关。在249例病例对照研究中(99 例 PLA2R阳性的MN患者、50 例 PLA2R 阴性MN患者及100例正常人)，Le等[10]发现HLA-DRB1*15∶ 01和HLA-DRB3*02∶ 02为PLA2R相关MN风险等位基因，无其他HLA等位基因与PLA2R相关MN显著相关。含293例PLA2R相关的MN患者和 285健康对照者的独立的队列研究验证了这一发现，98.7% PLA2R相关的MN患者携带至少一个HLA风险等位基因，其中72.2%患者携带HLA-DRB1*15∶ 01等位基因，69.9%患者携带HLA-DRB3*02∶ 02等位基因。多因素logistic回归模型评价单个SNP与遗传风险评分之间的关联性，显示 HLA-DRB1*15∶ 01(OR 24.9；95%CI 15.3～42.6；P=2.3×10-35)和 HLA-DRB3*02∶ 02(OR 17.7；95%CI 11.0～30.3；P=8.0×10-29)相互独立地与PLA2R相关膜性肾病密切相关。

足细胞基因表达谱研究

获得正常和疾病状态下足细胞特异性基因转录谱，对于开展足细胞功能维系和足细胞损伤分子机制的研究至关重要。在成功分离足细胞之前，研究人员多是通过微分离肾小球获得肾小球转录组，但肾小球中还包含血管内皮细胞和系膜细胞，多种细胞来源的转录组数据不能代表足细胞特异性基因表达谱。

Fu等[11]利用肾小球足细胞特异性表达绿色荧光蛋白标记的转基因小鼠，构建糖尿病肾病模型(STZ-eNOS-/-)后，流式细胞仪分选足细胞后进行基因表达谱分析，相较于正常对照小鼠，DN小鼠足细胞表达谱中上调的基因主要参与微管形成、细胞迁移和细胞运动等骨架结构调节通路，下调的基因参与RNA加工和内质网功能调节，提示糖尿病状态下足细胞mTOR通路和自噬/内质网应激反应的改变。

Ju等[12]应用计算机模拟分析方法，分离和鉴定特定细胞类型的基因表达。该方法利用迭代分类算法和机器学习算法，基于大量的肾小球转录组数据确定足细胞特异性的转录本。将已知的46个足细胞标记基因(如ACTN4，NPHS1，NPHS2，SYNPO，PTPRO等)作为阳性对照，48个足细胞不表达的基因(ACTA2，ADAM10，AGTR1，ALDOB，ALOX1等)作为阴性对照，为计算机提供标准的统计评分和细化标准，不断提炼预测足细胞特异性表达模式和信息条件，在全基因组水平上对细胞特异性基因进行高精度预测。将这种策略应用于显微切割获得的452个人肾小球微阵列数据集，预测了136个新的足细胞富集表达基因，结合人类蛋白质图集(human protein atlas，HPA)的免疫组化结果，确定了特异性表达于足细胞的基因，如PCOLCE2，PLA2R1，FGF1，PRKAR2B等。

通过荧光标记获得足细胞进行测序或芯片分析基因表达谱的策略，难以应用于临床患者。单细胞转录组是在单个细胞水平进行转录组测序分析的一项新技术。Lu等[13]通过肾小球单细胞测序，鉴定出足细胞表达基因群，并通过体外细胞基因干扰研究确定了其中参与维持足细胞骨架稳定的一批重要基因。研究人员通过磁珠法分离肾小球，酶解后获得单细胞，通过qPCR检测足细胞特异性表达基因podocin、synaptopodin和Wilms肿瘤蛋白(WT1)，筛选出20个足细胞进行单细胞测序。研究发现20个足细胞共同表达335个基因，其中239个基因在系膜细胞和内皮细胞中也有表达，主要参与能量代谢和蛋白质合成；92个基因特异性在足细胞中富集表达，足细胞表达量是系膜细胞或内皮细胞中的表达量的5倍以上。使用DAVID数据库功能分析显示，足细胞特异性富集表达基因主要与细胞伸展、细胞骨架、细胞粘附和离子转运等有关。研究人员认为足细胞富集基因可能在足细胞存活、维持足细胞独特结构和功能中发挥重要作用。92个基因中有27个(29.4%)基因，如PODXL、PTPRO、VEGFA、ENPEP、IQGAP2、ARHGAP24、CD59A、COL4A3和GADD45A等,已有研究明确其在足细胞结构功能中发挥重要作用。

足细胞损伤机制研究新进展

微小RNA(microRNA)在足细胞损伤中的作用microRNA表达存在组织特异性，肾脏富集的microRNA有miR-30a、miR-29a、miR-21、miR-143、miR-196b、miR-378、miR-27b、miR-148和let-7a等[14]。

miR-30是维持足细胞结构和功能的关键调控分子[15]。miR-30a及miR-30d在肾小球足细胞中特异性表达，并且在FSGS患者中显著下调[16]。TGF-β/Smad可通过Smad结合元件招募组蛋白去乙酰化酶3，与NcoR形成转录抑制复合体，降低miR-30d启动子转录活性[17]。miR-30靶向抑制Notch1和p53信号通路活性，减少足细胞凋亡[16]。miR-30还通过抑制TRPC6、Ppp3ca/cb/r1和NFAT3c等分子，调控足细胞钙/钙调磷酸酶通路的活化，维持足细胞骨架结构和功能[18]。

Gebeshuber等[19]研究发现miR-193a上调在FSGS发病中具有关键作用。miR-193a转基因小鼠迅速出现广泛足细胞融合、FSGS样病变和蛋白尿，转基因纯合子小鼠和杂合子小鼠miR-193a诱导表达后分别于6周和12周后死亡。miR-193a抑制足细胞重要转录因子WT1的表达，进而导致WT1靶基因PODXL、NPHS1，NPHS2、alpha-Actinin-4和synaptopodin等足细胞重要功能基因的表达下调，引发足细胞稳态系统的崩溃。

有研究认为肾小球壁层上皮细胞(PEC)作为肾脏潜在祖细胞参与足细胞损伤修复。Kietzmann等[20]发现miR-193a调节壁层上皮细胞向足细胞的转分化。正常肾组织中，miR-193a主要表达在壁层上皮细胞，抑制miR-193a表达可诱导壁层上皮细胞向足细胞转分化，表达PODXL、NPHS1和synaptopodin等足细胞标志物，而壁层上皮细胞相关分子Claudin-1、UCH-L1和 Pax-8等表达显著下调。在肾毒性血清肾炎模型中，锁核苷酸抑制miR-193a可显著降低新月形成和蛋白尿。

miR-29a与组织纤维化和蛋白质乙酰化相关。Wang[21]等发现糖尿病状态和TGF-β抑制足细胞miR-29表达，从而促进细胞外基质胶原I/III/IV、α平滑肌肌动蛋白(SMA)和波形蛋白(vimentin)mRNA和蛋白表达。Lin等[22]研究发现，糖尿病状态下miR-29a表达受到抑制，同时nephrin乙酰化水平降低，TUNEL实验显示足细胞凋亡； miR-29a抑制靶基因组蛋白去乙酰化酶4(HDAC4)的表达，对HDAC7a和组蛋白乙酰化转移酶p300/CB相关因子PCAF没有影响。糖尿病小鼠过表达miR-29a可抑制HDAC4表达，改善肾功能，恢复nephrin乙酰化水平，降低nephrin泛素化；糖尿病小鼠注射外源miR-29a反义寡核苷酸显著降低miR-29a表达，同时HDAC4表达上调，nephrin乙酰化水平降低，泛素化水平升高，足细胞凋亡增多。

免疫与造血系统异常与足细胞损伤足细胞可被病原相关分子模式(pathogen associated molecular pattern，PAMPs，如微生物病原体)或损伤相关分子模式(DAMP，如线粒体DAMPs)诱导的先天免疫应答所损伤。TLR9是识别病毒和细菌中非甲基化DNA(CpG-DNA)的模式识别受体，可表达于疾病状态下的足细胞。Xia等[23]和Bao等[24]发现TLR9可利用内源性线粒体DNA(mtDNA)作为配体来促进足细胞凋亡。该研究发现，足细胞内源mtDNA是TLR9的配体，足细胞损伤因子嘌呤霉素可诱导细胞内源mtDNA向溶酶体的转移，与TLR9结合，激活TLR9信号通路，上调促凋亡信号通路NF-κB和p38 MAPK活性，诱导足细胞凋亡。

炎症小体是由胞质内模式识别受体(PRR)参与组装的多蛋白复合物，是天然免疫系统的重要组成部分。Zhang等[25]发现同型半胱氨酸可激活足细胞的NLRP3炎性小体，诱导肾小球硬化；敲低NLRP3接头分子，凋亡相关点样蛋白(ASC)或抑制 caspase-1 活性可以改善蛋白尿、足细胞足突融合和肾小球硬化。Fu等[26]最新研究发现，足细胞是致狼疮性肾炎发病的直接参与者，足细胞中NLRP3炎症小体激活参与狼疮性肾炎的发病。研究显示，大量蛋白尿的NZM2328狼疮易感小鼠NLRP3和IL-1β的蛋白表达水平显著高于不伴有蛋白尿的对照组小鼠，蛋白尿小鼠足细胞中caspase-1的含量显著升高。狼疮性肾炎患者足细胞和尿液中NLRP3升高。NLRP3抑制剂MCC950可显著降低肾脏IL-1β的水平和足细胞caspase-1的活化，抑制足突融合，改善病理病变，降低蛋白尿。

可溶性尿激酶型纤溶酶原激活物受体(suPAR)是尿激酶型纤溶酶原激活物受体(uPAR)的可溶形式。suPAR通过与足细胞整合素结合，诱导足细胞迁移和凋亡，参与肾脏疾病，特别是FSGS和糖尿病肾病的发病进程[27-29]，被认为是导致FSGS的循环致病因子之一。高水平suPAR还与慢性肾脏病的发病和eGFR的下降相关[30]。Jochen Reiser课题组最新研究发现，suPAR源自骨髓Gr-1lo未成熟髓细胞[31]。将全身敲除uPAR的小鼠经亚致死剂量放射线全身照射后，输入野生型小鼠或uPAR基因敲除小鼠的骨髓细胞，形成骨髓嵌合体；输入uPAR敲除小鼠骨髓细胞的嵌合体小鼠体内几乎没有suPAR，LPS不能刺激小鼠产生蛋白尿；而输入野生型小鼠骨髓细胞的嵌合体小鼠经LPS刺激后，血液和尿液中suPAR水平升高，同时出现蛋白尿。NOD-scid IL-2rnull(NSG)严重免疫缺陷小鼠缺乏淋巴细胞和NK细胞，白细胞群体主要由髓系谱系细胞组成，LPS可以刺激NSG小鼠骨髓Gr-1lo未成熟髓细胞显着增加，进而出现suPAR表达升高和蛋白尿；移植蛋白尿小鼠的骨髓可导致受体小鼠产生蛋白尿，FSGS复发患者的外周造血干细胞输注到小鼠可引起小鼠骨髓Gr-1lo髓细胞扩增，血液和尿液suPAR升高，小鼠出现足细胞损伤和蛋白尿。上述研究进一步证实了循环suPAR在FSGS等肾脏疾病中的直接作用，而骨髓Gr-1lo未成熟髓细胞是suPAR的主要来源，提示suPAR相关性肾脏病可能源于骨髓或外周造血干细胞异常，干细胞移植可能是治疗suPAR相关肾脏疾病的可行策略。

小结:足细胞是肾小球滤过屏障重要组成部分。足细胞损伤是导致蛋白尿、肾小球硬化及肾功能进行性恶化的病理生理基础。单细胞测序和生物信息学分析绘制了足细胞特异性基因表达谱，提示维持足细胞功能和结构的重要基因。遗传学和基因编辑技术的进展为研究足细胞损伤和蛋白尿发生机制奠定了分子基础。非编码RNA、免疫因素、肾脏固有细胞及肾脏与肾外器官的相互作用在足细胞损伤中的作用，值得关注和进一步研究。足细胞损伤进程中的系列关键分子均可作为足细胞定向治疗的潜在靶标，值得系统解析和评价，多能干细胞移植作为治疗慢性肾脏病，包括足细胞损伤的新途径，日益受到重视。