Krüppel样因子对肾脏疾病的调控作用

1950年，Gloor发现了一种能导致果蝇身体严重畸形的突变，命名为Krüppel，意为“跛子”。随后，Nüsslein-Volhard和Wieschaus发现Krüppel突变在胚胎发育早期阻碍果蝇体细胞分裂，具胚胎致死性[1]。哺乳动物基因组中与Krüppel同源的基因被称为Krüppel样因子(KLF)，其羧基末端高度保守，具有三个串联的Cys2His2锌指结构，通过与富含GC的DNA序列相互作用介导转录活性。

人类基因组包含17个KLF编码基因，根据功能差异可分为三组：第1组为转录抑制因子，KLF3、-8和-12；第2组为转录激活因子，KLF1、-2、-4、-5、-6和-7；第3组的KLF能结合并增强共抑制蛋白SIN3A活性，KLF9、-10、-11、-13、-14和-16；而KLF15和KLF17因功能尚未完全阐明，未被进行归类[2]。除KLF1仅特异性表达于造血细胞，其他家族成员广泛表达。KLFs的生物功能具有高度多样性，包括调节细胞生长，分化和死亡; 内皮和上皮功能; 脂肪和糖代谢和线粒体功能等[2]。近来，KLFs在肾脏中的表达和功能被广泛研究，显微切割肾单位的不同节段并进行基因表达谱深度测序，揭示了KLFs在肾单位不同节段的表达模式，越来越多的研究关注KLFs在肾脏中的功能。

KLFs在肾单位发育中作用

KLFs作为转录因子调节细胞增殖、分化、发育和程序性死亡，最初发现果蝇KLF纯合突变导致胚胎胸部和前腹部发育异常，随后在哺乳动物小鼠中发现，红系Krüppel样因子(EKLF)对胚胎肝脏红细胞生成的最后步骤至关重要，EKLF-/-纯合小鼠将发生致命的β地中海贫血[3]。此外，KLF4表达与生长停滞有关，最早发现在生长停滞的小肠上皮细胞中差异表达[4]，随后证实其在多种上皮细胞中通过诱导细胞周期G1/S停滞起负性调控细胞增殖的作用[5]。

在肾脏发育过程中，转录因子环磷腺苷效应元件结合蛋白(CREB)、p53和KLF4及共激活因子CREB结合蛋白(CBP)之间协同相互作用，调控缓激肽B2受体(B2R)基因的表达，进而调控肾单位的终末分化和正常功能[6]。小鼠胚胎发育早期，Klf6在Wolffian导管、输尿管芽、集合管和系膜中选择性表达，这种表达模式表明Klf6可能在肾脏，特别是肾脏集合管系统的发育中起作用[7]。此外，KLF12表达于远端小管中，特别是内髓集合管，参与了出生后集合管的成熟，研究发现KLF12在出生后15d开始上调并通过增强尿素转运蛋白A1(UT-A1)而非上皮钠通道(ENaC)的启动子活性来调控其表达[8]。

KLFs与肾小球损伤

肾小球滤过功能障碍是慢性肾脏病的主要特征之一，足细胞是具有有限复制能力的高度分化和生长停滞的细胞，维持肾小球滤过屏障的完整性，其损伤参与多种肾脏疾病进程，如局灶节段性肾小球硬化(FSGS)、HIV相关性肾病(HIVAN)和糖尿病肾病等。足细胞特异基因和裂孔膜相关基因的启动子保守性分析显示存在共同的KLF结合位点，提示KLF家族蛋白在特异性调控足细胞功能中的潜在作用[9]。

KLF15也称肾脏富集的KLF，是一种足细胞分化调节因子，KLF15基因缺陷将导致足细胞损伤易感性增加[10]。ChIP结果显示KLF15能够通过结合足细胞表面标志物(nephrin、synaptopodin和podocin)的启动子区，诱导足细胞分化，作为关键调控因子参与维甲酸的肾脏足细胞保护过程[10]。糖皮质激素(GC)是治疗原发性肾小球病变的主要治疗手段，可诱导KLF15表达并增加糖皮质激素受体与KLF15启动子的亲和性，参与激素介导的足细胞损伤修复过程。此外，肾小球中KLF15的低表达与原发性FSGS和微小病变患者的激素抵抗相关，提示其可作为预测GC治疗反应性的潜在标志物[11]。

线粒体稳态对维持高能量代谢需求的足细胞正常功能至关重要，对HIV感染的足细胞和HIV转基因小鼠肾小球转录本进行分析，发现KLF家族成员中仅KLF6表达发生显著改变且呈明显低表达。特异性足细胞Klf6敲除的C57BL/6小鼠品系具有FSGS易感性[12]，KLF6调控线粒体细胞色素C装配基因SCO2，是一种早期损伤应答基因，对应激时维持线粒体功能、防止细胞色素C释放和内源性凋亡途径激活至关重要[12]。

KLF4与其他3种多能重编程因子(OCT4，SOX2和c-MYC)的异位表达能诱导体细胞重编程为诱导性多能干细胞(iPS)。肾脏中，KLF4表达于足细胞和内皮细胞，研究发现蛋白尿小鼠模型和肾病综合征患者肾活检组织中KLF4表达降低[13]。通过Klf4质粒转染和足细胞特异性四环素诱导系统恢复阿霉素肾病(ADR)小鼠的Klf4表达，或使用血管紧张素Ⅱ受体拮抗剂(ARB)治疗后，能抑制nephrin启动子的甲基化并减少小鼠尿蛋白，提示KLF4对足细胞特异基因的表观调控作用[13]。

KLF6和KLF15在系膜细胞中也发挥重要功能。在后肾发育过程中，Klf6表达于Wolffian导管和输尿管芽及其分支，分化早期阶段小球中并不表达，但随着不断发育在毛细血管阶段可表达于小球系膜细胞[7]。在C5b-9复合物介导的肾小球系膜细胞损伤中，ATF3可通过上调KLF6和Gadd45α的表达参与系膜细胞凋亡[14]。此外，在Thy-1大鼠模型中，KLF15可能通过E2F1调节细胞周期调节蛋白(CDK2和cyclin D1)的表达抑制系膜细胞增殖，提示其可成为系膜增生性肾小球肾炎治疗干预的潜在靶点[15]。

KLFs与肾小管间质病变及纤维化

CLC-K1和CLC-K2是在大鼠肾脏特异表达的CLC型氯离子通道，称为CLC-K，主要分布于髓袢，KLF15通过转录调控myc相关锌指蛋白(MAZ)抑制CLC-K1和CLC-K2氯离子通道的表达,故KLF15蛋白定位于在不表达CLC-K的肾脏细胞中[16]。KLF12也表达于远端小管中，特别是内髓集合管，参与了出生后集合管的成熟[8]。然而，目前尚不明确KLF12或KLF15是否参与氯化物或尿素转运。此外，Lee等[17]的基因表达谱分析结果显示，与其他KLFs相比，KLF9和KLF10在肾单位的部分节段中显著高水平表达。在体外培养的小鼠远端小管上皮细胞中KLF9为盐皮质激素受体的潜在下游靶点，但仍需进一步的研究来评估这些锌指蛋白是否参与肾脏离子通道病变。

TGF-β信号是上皮细胞周期阻滞和上皮细胞间充质转换(EMT)的共同调节因子，KLF4与 TGF-β呈现双向调节的特性。一方面，在高糖刺激的人近端肾小管细胞中过表达KLF4，能抑制TGF-β介导的炎症相关蛋白巨噬细胞移动抑制因子(MIF)和单核细胞趋化蛋白1(MCP-1)表达的增加[18]。在巨噬细胞中，KLF4能与Smad3竞争共激活因子p300/cAMP反应元件结合蛋白，从而抑制TGF-β转录。另一方面，KLF4的功能受转录水平和转录后调控，TGF-β1通过经典和非经典途径诱导血管平滑肌中KLF4磷酸化，形成KLF4-Smad2 复合物，共激活TGF-β1受体[19]。TGF-β还能通过Cdh1/APC信号通路介导KLF4的泛素化和蛋白酶体的降解[20]。此外，体内体外研究发现Dnmt1参与TGF-β1介导的KLF4启动子甲基化过程，促进肾脏上皮细胞的EMT，而过表达KLF4能诱导E-cadherin和ZO-1的表达，下调α-SMA和成纤维细胞特异蛋白-l(FSP-1)表达，从而抑制EMT过程[21]。

KLF5主要在集合管上皮细胞中表达，与CCAAT增强子结合蛋白(C/EBPα)协同作用参与炎症和纤维化过程。Klf5+/-单倍剂量不足的小鼠在单侧输尿管结扎术后表现为肾脏保护作用，伴随巨噬细胞M1型向M2型的明显转变，肾脏纤维化较轻[22]。Chen等[23]研究发现，单侧输尿管梗阻模型中基质硬度调节Klf5/Klf4表达，增加小鼠近端肾小管细胞的基质硬度导致Klf5的显着上调伴随Klf4的下调，参与肾纤维化进程。基质刚度增加时，可激活ERK信号，诱导Yes相关蛋白1(YAP1)核移位并阻碍KLF5降解，而降低基质刚度则直接抑制ERK/YAP1/Klf5/cyclin D1轴。

除调控足细胞中线粒体功能外，KLF6还表达于肾近端小管细胞。KLF6可转录调节肝纤维化中的TGF-β表达。在糖尿病Ren-2大鼠模型和高糖刺激的近端小管细胞中Klf6表达增加，在体外培养的近端小管细胞中过表达Klf6，能促进TGF-β1表达并且促进EMT[24]。

KLF15在高蛋白饮食喂养的5/6肾切除大鼠的肾间质中低表达，限制蛋白饮食能增加KLF15的表达，减轻5/6肾切除大鼠肾纤维化[25]。体外研究已证实KLF15能通过ERK/MAPK和JNK/MAPK信号通路抑制TGF-β1信号转导，从而发挥抗纤维化作用[26]。这些研究均表明KLFs在肾纤维化中发挥重要作用。

KLFs与肾血管损伤

KLF家族在内皮生物学功能中存在一些重叠，但它们在调节关键下游靶标的机制不尽相同。KLF2和KLF4转录因子是内皮细胞稳态的关键调节因子，由于存在结构和功能上的相似性，二者在维持内皮稳态方面功能相似[27]。KLF2和KLF4均为小鼠胚胎血管生成的关键因子，在胚胎发生过程中Klf2和Klf4单敲和双敲动物模型都存在不同程度的血管损伤。此外，炎性细胞因子和非层流血流诱导内皮功能障碍并促粘连和促血栓形成，而KLF4和KLF2在上皮细胞和血管内皮细胞中高度表达，参与抗炎和抗血栓[27]。

过表达Klf4的内皮细胞基因组转录谱分析显示，多个差异基因参与内皮功能炎症、血栓形成、血管舒缩、血管发育和氧化应激。在缺血再灌注肾损伤模型中KLF4对急性肾损伤(AKI)具有内皮保护作用，内皮细胞Klf4敲除增加炎症和黏附分子(ICAM-1、VCAM-1)表达，加重AKI[28]。此外KLF4还参与他汀类药物抗缺血性AKI的保护作用，内皮细胞中KLF4能直接抑制p65调节NF-κβ通路，下调细胞黏附分子的表达和改善炎症细胞浸润[28]。

Klf2于哺乳动物胚胎8.5d开始表达，内皮特异性Klf2基因敲除小鼠由于丧失血管完整性，死于出血和高输出性心力衰竭[29]。在体外暴露于层流切变应力的肾小球内皮细胞，能激活ERK5信号通路，上调KLF2和其下游分子内皮细胞一氧化氮(eNOS)、血栓调节素(THBD)和内皮素1(ET-1)表达，提示KLF2的内皮保护作用[30]。在人类糖尿病肾活检样本和链脲佐菌素(STZ)诱导糖尿病大鼠模型中，肾小球KLF2表达明显降低。特异性内皮细胞Klf2敲除的杂合小鼠在STZ诱导糖尿病肾病模型中表型更重，表现为蛋白尿、小球肥大和内皮损伤均更重，有趣的是足细胞损伤也更为突出[31]。他汀类药物治疗小鼠缺血再灌注损伤也能诱导KLF2表达[32]。

肾移植后，由于抗体介导的慢性排斥反应或钙调磷酸酶抑制剂毒性，可能继发血栓性微血管病，肾移植后介导内皮损伤的机制仍然知之甚少。在非典型溶血性尿毒症的小球转录本分析中，KLF2的表达轻度升高，然而肾移植相关血栓性微血管病的小球转录本分析发现KLF2和KLF4均降低[33]，提示KLF介导的基因表达调控更为复杂。

KLFs与免疫调节

小鼠的基因靶向敲除研究揭示了KLFs在髓系和淋巴系细胞成熟中的生理作用，多个KLF家族成员是T细胞运输、T调节细胞分化或抑制功能、单核/巨噬细胞以及B记忆细胞成熟、激活和更新等重要信号通路的下游靶标。

KLF2和KLF4均在T细胞中表达，参与免疫调控。KLF2可促进小鼠诱导性调节T细胞(iTregs)的产生，可作为治疗肾移植后细胞排斥的潜在靶标[34]。KLF4是小鼠巨噬细胞极化的关键调节因子，研究发现KLF4与Stat6协同作用诱导M2型巨噬细胞的产生，并通过螯合NF-κB活化所需的共激活因子来抑制M1型巨噬细胞的活化，且KLF4缺陷的巨噬细胞表现为促炎症基因上调[35]。

表1 KLFs表达模式和功能

小结:KLFs在维持肾脏稳态中发挥多方面的作用，且相互作用。既往研究关注KLFs在发育和再生中的重要作用，近年来研究提示KLFs同时也参与肾小球疾病、炎症、肾纤维化和血管损伤，而这些锌指转录因子的表达、调控和功能在肾脏生理病理中发挥的重要作用还有待研究者们进一步探索。