孕前扩展性单基因病携带者筛查的临床应用研究

赵琼珍，康苏，张兆肖，刘若男，袁琳琳，黄卫东

(新疆佳音医院，乌鲁木齐 830000)

随着全球对不孕症认识的提高，生殖专家持续对治疗方法进行改进发展。孕前扩展性携带者筛查(Preconception expanded carrier screening，PECS)用于检测携带致病变异或突变基因的健康个体。如果夫妻双方都携带同一基因的致病变异，或者女性携带X-连锁隐性疾病相关的致病变异，夫妻生育患儿的风险就会增加。欲使用辅助生殖技术(ART)的夫妇可以选择PECS，以获知他们的生殖潜力，并在寻求治疗之前选择更好的策略。特别是，PECS可以帮助患者和临床医生确定一对夫妇是否需要进行胚胎植入前单基因病遗传检测(PGT-M)，降低子女患单基因遗传病的发病风险。据估计，目前全世界每10 000名儿童中就有30人受到遗传疾病的影响[1]。根据在线人类孟德尔遗传数据库(OMIM)，有报道2 933个X-连锁和常染色体隐性遗传单基因病[2]。这些疾病具有相对较高的携带频率，促使美国妇产医师协会(ACOG)和美国医学遗传基因组学会(ACMG)创建临床指南，对孕前夫妇遗传风险评估和如何适当筛选患者向医生提供建议[3]。最初，遗传性单基因病携带者筛查侧重针对特定族裔人群，例如高加索人的囊性纤维化和非洲的镰状细胞贫血[4]。如今，通过高通量基因分型和测序，扩展性携带者筛查已发展为适用于泛族群，并扩大了检测范围[5]。尽管PECS的应用获得了多种好处[6-7]，临床医生对基因组数据的解释仍然是一个挑战[8]。变异解释、临床相关性、标准化实践、经济敏感性和社会影响是现代相关从业者所面临的持续挑战[7，9]。由于这些问题引起的临床偏好的可变性，ACOG或ACMG指南指出PECS是可以接受的，但每个临床依据或实践都应建立产前筛查的标准方法[3，10]。此外，由于缺乏标准化，世界某些地区几乎不实施遗传病携带者筛查。但在许多民族不同人群中使用PECS可以增加对各种遗传病携带者状态的检测，并迅速提高专业水平，从而支持更广泛的临床应用[3，10]。

本研究旨在评估新疆佳音医院不孕不育夫妇的PECS结果，更好地了解常染色体隐性遗传病和X-连锁遗传病基因的携带率。另外，这项研究将评估新疆地区人口中高风险夫妇检出率(“高风险夫妇”定义为夫妇为同一致病基因的携带者)。研究结果将有利于扩展新疆人群特有的遗传风险的临床认知。此外，可以增进对生殖遗传学的认识，并有助于优化早期检测方法以防止遗传病的发生。因此，我们期望这项研究能更好地促进不孕不育夫妇的生殖咨询和决策。

材料和方法

一、研究对象

回顾性分析2019年11月至2020年5月于新疆佳音医院所有接受PECS的ART患者资料。分析PECS panel所检测遗传疾病的总体携带情况，以及各族群的携带率。

二、方法

1.PECS受检者：来我院进行ART治疗的不育患者均于ART治疗前经过孕前遗传咨询后接受PECS，年龄20～55岁，包括汉族、维吾尔族、回族、哈萨克族和其他民族。充分告知患者检测手段、局限性及可能存在的风险。本研究通过伦理审查，患者自愿接受PECS，采血前均已签署知情同意书。

2.PECS panel：PECS针对中国常见的遗传病如遗传性耳聋、β地中海贫血、苯丙酮尿症、进行性假肥大性肌营养不良、血友病、肝豆状核变性在内的多种常见遗传病，和《中国罕见病参考名录》中收录的白化病、代谢病、肌萎缩性脊髓侧索硬化症等致病基因明确、遗传方式主要为隐性的单基因遗传病，以及ACMG推荐的新生儿及儿童遗传代谢病等在内的206种遗传病。

3.检测方法：采集患者5 ml血液，用血液基因组DNA提取试剂盒(北京天根生化科技)提取DNA。文库构建按照Ion Plus Fragment Library Kit V3(Thermo，美国)说明书进行。采用Qubit 3.0 Fluorometer(Thermo，美国)测定文库浓度。使用Illumina Novaseq 6 000高通量测序平台进行全外显子组基因测序检测，Sanger测序方法进行验证。

4.检测结果咨询：对检测出的阳性携带者进行遗传咨询。被检出的高风险夫妇建议使用产前诊断和/或胚胎植入前单基因病遗传检测(PGT-M)以避免疾病遗传。

5.观察/分析指标：PECS panel单基因病相关变异的总体检出情况(包括最常见的致病基因携带种类)；族群/性别的携带率差异。

三、统计学分析

应用R语言统计分析软件对数据进行处理分析。chisq.test(data)程序进行统计，P<0.05表示差异有统计学意义。根据性别和民族来计算各亚群的携带者状况。

结 果

一、患者一般资料

共有1 777例受检者(包括812对夫妇)在进入ART治疗前接受了PECS。受检人群年龄20～55岁，平均年龄(33.5±4.9)岁，主要包括汉族、维吾尔族、回族、哈萨克族和其他民族。

二、总检出情况

单基因病总携带率18.23%(324/1 777)，除10例为纯合突变、1例为杂合突变外，其余均携带至少一种与常染色体隐性杂合变异；其中，66.67%(n=216)携带1种基因变异，24.07%(n=78) 携带2种基因变异，5.86%(n=19)携带3种基因变异，2.47%(n=8)携带4种基因变异，0.62%(n=2) 携带5种基因变异。在我们的研究中，无受检者携带超过5种变异的情况。在研究人群中共鉴定出了106个基因中的240个致病变异体。

三、族别/性别的携带率差异

受检者中女性915例，女性群体的平均年龄为(33.5±4.9)岁，其中174例为至少一个条件的携带者(19.02%)，741例(80.98%)为阴性；男性受检者862例，平均年龄为(34.21±5.08)岁，其中149例(17.29%)被发现是至少一个条件的携带者，713例(82.71%)为阴性。女性携带率19.02%(174/915)，男性携带率17.29%(149/862)，性别间无统计学差异(P>0.05)。

受检者中汉族1 103例、维吾尔族441例、回族91例、哈萨克族74例、其他民族68例；各族群的携带率从16.68%～22.06%不等，族群间携带率无统计学差异(P>0.05)(表1)。

表1 不同民族致病基因携带率[n(%)]

四、PECS panel常见携带基因

PECS panel上分析的206种遗传病的294个不同基因中，最常见的相关疾病列表如表2所示。检出血色素沉着症1型(HFE基因)3.88%(69/1 777)，是受检人群中最常见的变异，其次是常染色体隐性耳聋1A型(GJB2基因)3.38%(60/1 777)、Gilbert综合征(UGT1A1基因)1.74%(31/1 777)、囊性纤维化(CFTR基因)0.96%(17/1 777)和Krabbe病(GALC基因) 0.90%(16/1 777)等(表2)。

表2 PECS panel检出前9种致病基因[n(%)]

五、不同族群的基因变异检出情况

不同族群的携带者状况中，汉族至少携带一种基因突变的携带率为19.04%(210/1 103)，维吾尔族为22.90%(101/441)、回族为20.88%(19/91)、哈萨克族为34.70%(17/74)，其他民族为16.18%(11/68)(表3)。

表3 不同民族主要基因变异检出情况[n(%)]

六、夫妻双方同时检测结果

812对夫妇接受了PECS，46对(5.67%)检出携带同一致病变异的高风险夫妇；其中，13对(28.26%)血色素沉着症1型(HFE基因)，12对(26.09%)常染色体隐性耳聋1A型(GJB2基因)，5对(10.87%)Gilbert综合征(UGT1A1基因)，3对(6.52%) Krabbe病(GALC基因)，2对(4.35%)苯丙酮尿症(PAH基因)，2对(4.35%)囊性纤维化(CFTR基因)。经过遗传咨询，46对高风险夫妇中的13对(28.26%)选择使用PGT-M筛选出不携带相关单基因病的胚胎。

讨 论

高通量测序技术的进步可以同时检测多个基因，大大降低了PECS成本。同时随着ART治疗的进步，特别是PGT-M的应用，部分国外生殖中心已常规应用PECS技术，提高助孕成功率。目前，我国国内临床针对遗传性疾病筛查的咨询能力不足，大众人群对携带者筛查认知度低，孕前人群优生优育观念不足，基于以上原因，国内尚无PECS的临床应用的报道[11-12]。

据报道，孟德尔遗传疾病占婴儿死亡率的近20%，在发达国家住院率高达18%[13]。新疆乃至整个中国还没有对人群中多个隐性遗传病携带者的患病率和发病率进行报道。目前为止，国内尚没有一个经多学科组织批准的标准化指南，用于建议ART治疗的患者是否进行遗传病携带者筛查。

本研究为新疆佳音医院生殖中心就诊的患者提供孕前PECS，并遵守美国妇产医师协会(ACOG)和美国医学遗传基因组学会(ACMG)目前的实践指南[14-15]。第一次分析了在新疆不孕不育人群中多个隐性遗传疾病的携带者状况，从而有利于在ART治疗中指导患者更好地做出生殖决策，以降低遗传病的发生率。

本项研究中，总体研究人群中至少有1种常染色体隐性致病变异的检出率是18.23%(324/1 777)。Franasiak等[16]于2016年对6 643名受检者进行了PECS，检测出携带率为25.10%。已发表的研究和我们的分析结果有所不同，可能源于所分析的群体、使用的不同遗传病携带panel以及平台的差异[17]。

本研究基于PECS结果分析，评估接受ART治疗的夫妇怀上一个常染色体或X-连锁疾病患儿的风险。分析表明，受检夫妇中携带同一基因突变的比例为5.67%。Franasiak等[16]报告高风险不孕夫妇的频率为0.20%。西班牙团队利用NGS技术在辅助生殖人群中进行遗传病携带者筛查中发现138对ART夫妇中有7对夫妇(5.07%)携带同一基因的突变(涉及6种遗传病)[18]。在分析不同民族的携带者状况中，新疆地区不同民族受检者的总携带率及其携带致病基因种类均有差异。

本研究中，发现812对夫妇中46对(5.67%)为高风险不孕夫妇，其中检出最高者是血色素沉着症1型(HFE基因)28.26%(13/46)，其次是常染色体隐性耳聋1A型(GJB2基因)26.09%(12/46)、Gilbert综合征(UGT1A1基因)10.87%(5/46)。所有这些高风险夫妇都需要进行临床遗传咨询以及生殖选择咨询。检测结果有利于临床医生进行更个性化的遗传咨询，以使患者充分知情并做出符合患者价值的生殖选择[19-20]。

此外，本研究中使用的扩展性携带者筛查panel使用了二代测序技术(next generation sequencing)，这是目前有效的检测平台[11，17，21]。该panel针对多个民族群体基因测序，而非针对特定的族裔群体。一些研究人员证明，在使用扩展性携带者筛查而不是针对特定族裔的panel时，传统的族裔/民族标签几乎没有或根本没有价值[22-23]，应向所有个人提供扩展性携带者筛查[24-25]。因此，在生殖医疗之前，建议根据孟德尔疾病的地区性流行和严重程度，考虑对夫妇双方进行孕前遗传病携带者筛查和遗传咨询。