五氯硝基苯亚急性暴露对卵巢甾体激素合成的影响

李雯，骆海燕，淡清华，郐艳荣，高小博，陆彩玲*

(1.国家卫生健康委科学技术研究所遗传优生中心，北京 100081；2.北京协和医学院研究生院，北京 100730)

卵巢作为雌性哺乳动物的性腺，其主要功能是分泌甾体激素及排卵。孕酮和E2作为卵巢组织分泌的主要甾体激素，其合成及分泌在女性月经周期、卵泡发育、生殖妊娠等过程中均发挥着重要的调节作用。类固醇激素合成急性调节蛋白(Steroids acute regulatory synthesis protein，StAR)是甾体激素合成的限速酶之一，它能够将细胞质中游离的胆固醇转移到线粒体内膜中，这是甾体激素合成的初始步骤[1]。在胆固醇侧链裂解酶(Cytochrome P450scc enzyme，P450scc)的作用下，进入线粒体后的胆固醇被转化为孕烯醇酮，后者经过3β-羟甾脱氢酶(HSD3b)、细胞色素P450c17a酶(CYP17a1)等一系列酶的催化可生成孕酮及雄烯二酮等激素，其中雄烯二酮可在芳香化酶(Aromatase)的作用下转化为E2[2]。卵巢内甾体激素的合成是一系列甾体激素合成酶综合调控的过程，这一过程易受到环境因素如农药、增塑剂、香烟烟雾等的干扰，从而导致激素合成及分泌异常，造成卵巢早衰、生育力下降等不良后果[3-5]。

五氯硝基苯(Pentachloronitrobenzene，PCNB)，又称氯喹(Quintozene)，是一种常见的有机氯农药，常用于农作物、中草药的种植过程及城市中花卉、草坪等的病害防治，使用范围广泛[6]。PCNB化学性质稳定、半衰期长，使用后可在土壤、水体中长期残留[7]。人体可通过饮食、饮水、皮肤接触等多种方式接触PCNB，人群暴露风险高[8]。PCNB可造成肝脏损伤，且具有潜在的致癌性[9]。另外有研究发现，PCNB及其代谢产物可穿过胎盘屏障，小鼠妊娠期PCNB暴露可导致子代肾脏发育不全、腭裂，并增加胎儿死亡率[10]。Metcalfe等[11]在对日本青鳉鱼的研究中发现，PCNB暴露可导致受精卵发育异常，造成眼部畸形、大脑发育迟缓等不良后果。作为一种常见的环境污染物，目前国内外对PCNB的研究主要集中在残留物检测、降解等方面，对生殖系统尤其是卵巢功能影响方面的研究不多。我们实验室前期研究发现，PCNB连续暴露7 d可降低大鼠血清孕酮水平、增加生长卵泡比例，表明PCNB可影响正常卵巢功能[12]。亚急性暴露指≤30 d的重复染毒，在毒理学中常用于研究相对有限时间内反复暴露某一毒物对生殖系统等的影响[13]。本研究在前期研究的基础上通过对3周龄雌性SD大鼠连续PCNB亚急性暴露28 d，初步探讨PCNB亚急性暴露对雌性大鼠甾体激素合成的影响。

材料与方法

一、实验动物

3周龄雌性SD大鼠，体重(40±5)g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司，实验动物许可证：SCXK(京)2016-0006，饲养于国家卫生健康委科学技术研究所SPF级实验动物中心，饲养环境温度(24±2)℃，湿度50%～70%，光照12 h明暗交替，提供充足的粮食和水、自由进食。所有实验均通过国家卫生健康委科学技术研究所动物伦理委员会批准(伦理批号：2016-017)。

二、主要试剂及仪器：PCNB(Sigma，美国)，玉米油(阿拉丁，中国)，孕酮测定试剂盒、E2测定试剂盒(Roche，瑞士)，BCA蛋白定量试剂盒(Thermo，美国)，StAR兔多克隆抗体、Aromatase兔多克隆抗体(ABclonal，美国)，P450scc兔多克隆抗体(Cell Signaling，美国)，β-actin小鼠单克隆抗体(Sigma，美国)，辣根过氧化物酶-山羊抗兔IgG抗体、辣根过氧化物酶-山羊抗小鼠IgG抗体(中杉金桥)；超声波细胞粉碎机(Branson SLP，美国)，全自动酶标检测仪(Biotek，美国)。

三、研究方法

1.动物分组及PCNB亚急性暴露：将3周龄雌性SD大鼠30只随机分成3组：给予50 mg·kg-1·d-1PCNB灌胃给药的为低剂量组，给予100 mg·kg-1·d-1PCNB灌胃给药的为高剂量组，给予等体积玉米油灌胃的为对照组，每组10只，连续灌胃28 d。灌胃期间每日对大鼠进行称重并记录，同时对大鼠毛发、粘膜和自主活动等一般情况进行观测并记录。

2.组织取材：末次染毒24 h后通过阴道涂片观察大鼠发情周期，于发情间期对大鼠进行麻醉，取静脉血后将大鼠安乐死，分离双侧卵巢组织，置生理盐水中漂洗，剔除周围脂肪组织、称重并计算卵巢系数，卵巢系数=卵巢湿重/体重×100%。之后迅速将一侧卵巢组织放入10%中性福尔马林中固定，另一侧放入液氮中冷冻备用。

3.血清E2、孕酮浓度测定：收集大鼠静脉血于采血管中，室温静置一段时间后2 500g离心15 min，移取血清于1.5 ml EP管中，置于-80℃冰箱保存待测。利用孕酮、E2检测试剂盒检测血清孕酮和E2水平，实验步骤严格按照说明书进行。

4.卵巢组织蛋白质提取及定量：大鼠灌胃28 d后，于发情间期处死，取大鼠卵巢组织，将组织剪碎后加入组织裂解液及蛋白酶抑制剂，用超声波细胞粉碎机将组织进一步打碎，冰上继续裂解30 min后，4℃ 16 000g离心15 min，收集上清，利用BCA蛋白定量试剂盒进行蛋白定量。

5.Western Blot检测：蛋白变性后通过十二烷基硫酸钠-聚丙烯酰胺(SDS-PAGE)凝胶电泳分离蛋白，然后将其转印到聚偏二氟乙烯(PVDF)膜上。电转结束后用5%脱脂奶粉封闭1 h，所有一抗均按照1∶1 000稀释后4℃孵育过夜，磷酸盐吐温缓冲液(PBST)漂洗;所有二抗均按照1∶2 000稀释后室温孵育1 h，PBST漂洗，化学发光法(ECL)显影。利用Image J软件分析目标条带的灰度值。β-actin为内参，每组实验至少重复3次。

四、统计学分析

结 果

一、PCNB亚急性暴露对大鼠一般情况及卵巢系数的影响

灌胃期间各组大鼠毛发、粘膜和自主活动等一般情况良好，未出现异常或死亡。在PCNB亚急性暴露期间，高、低剂量组大鼠的体重变化、卵巢系数与对照组比较均无显著差异(P>0.05)(图1)。

A：体重变化情况；B：卵巢系数图1 PCNB亚急性暴露后SD大鼠体重及卵巢系数的变化情况

二、PCNB亚急性暴露对SD大鼠血清孕酮和E2水平的影响

电化学发光法检测发现，高、低剂量组大鼠血清孕酮水平均显著高于对照组，血清E2水平均显著低于对照组(P<0.05)(图2)。

三、PCNB亚急性暴露对大鼠卵巢组织StAR、P450scc和Aromatase表达水平的影响

Western Blot结果显示，大鼠卵巢组织中StAR的表达量低剂量组>高剂量组>对照组，各组组间差异均无统计学意义(P>0.05)；大鼠卵巢组织中P450scc表达量高剂量组>对照组>低剂量组，各组组间差异均无统计学意义(P>0.05)；低、高剂量组大鼠卵巢组织中Aromatase表达水平均显著低于对照组(P<0.05)，并呈剂量依赖性下降(图3)。

A：孕酮；B：E2。与对照组比较，*P<0.05图2 亚急性暴露PCNB后SD大鼠血清孕酮及E2水平的变化

A：Western Blot检测；B：灰度分析柱状图。与对照组比较，*P<0.05图3 PCNB亚急性暴露后SD大鼠卵巢组织中StAR、P450scc和Aromatase表达情况

讨 论

多项研究表明，卵巢是多种环境污染物的重要靶器官，环境因素是导致卵巢功能异常的重要原因之一[14]。作为一种常见的环境污染物，PCNB对卵巢功能影响的研究目前鲜少报道。本研究在实验室前期工作的基础上进一步探究了PCNB亚急性暴露对SD大鼠卵巢功能的影响。我们对不同剂量PCNB暴露后大鼠血清孕酮和E2水平进行了检测，结合卵巢甾体激素合成关键酶的表达变化情况，初步探索了PCNB亚急性暴露对卵巢功能的影响及可能机制。

本研究发现，PCNB亚急性暴露期间大鼠的一般情况良好，各实验组SD大鼠体重与对照组相比没有显著差异(P>0.05)，提示PCNB亚急性暴露对SD大鼠无显著系统毒性，这与Khera等[15]的研究结果一致。PCNB连续暴露28 d后各实验组大鼠血清孕酮水平均显著高于对照组，血清E2水平均显著低于对照组(P<0.05)。为探究PCNB亚急性暴露对甾体激素合成关键酶的影响，本研究检测了各实验组SD大鼠卵巢组织中StAR、P450scc以及芳香化酶的表达情况。Western Blot结果显示，与对照组比较，各实验组SD大鼠卵巢组织StAR的表达均上调，其中低剂量组>高剂量组，但各组组间无统计学差异(P>0.05)；与对照组比较，低剂量组大鼠卵巢组织中P450scc表达上调，高剂量组P450scc表达下调，但各组组间均无统计学差异(P>0.05)。甾体激素合成关键酶StAR和P450scc的表达量在低剂量组均高于高剂量组，这与大鼠血清孕酮水平的表达情况相一致。Western Blot结果提示，StAR及P450scc可能均在PCNB亚急性暴露导致的血清孕酮水平上调中发挥作用。芳香化酶作为卵巢组织合成E2的限速酶，PCNB暴露后其蛋白表达量显著下降，这与血清E2水平下降相吻合，提示PCNB亚急性暴露可能通过下调芳香化酶的表达量而影响卵巢组织E2的分泌。本实验室前期研究了PCNB暴露7 d对大鼠卵巢功能的影响，发现PCNB可显著下调血清孕酮水平(P<0.05)，并导致血清E2水平下降，但差异无统计学意义(P>0.05)[12]。这与本实验发现PCNB亚急性暴露引起大鼠血清孕酮升高、血清E2下降的结果不一致，导致这一现象的原因可能与PCNB体内暴露时间不一致有关；另外本次实验观测终点时大鼠已进入青春期，体内参与激素调控的机制更为复杂，对甾体激素生成也可能产生影响。实验室前期研究均发现，PCNB暴露7 d显著上调大鼠卵巢中StAR的表达[12]，本研究也检测到PCNB亚急性暴露上调大鼠卵巢StAR的表达水平，提示StAR在PCNB暴露导致的卵巢甾体激素分泌紊乱中发挥了不可忽视的作用。本课题组前期研究发现，PCNB暴露7 d可导致卵巢生长卵泡比例显著升高，卵巢组织最大切面截面积增大[12]；本次实验观察到PCNB暴露后导致SD大鼠卵巢系数增加，但差异无统计学意义(P>0.05)，提示PCNB亚急性暴露可能对大鼠卵巢发育产生一定影响。

PCNB进入哺乳动物体内后，可产生包括五氯苯酚、五氯硫酚、五氯硫岛代苯甲醚在内的多种代谢物质[16]，其中的某些代谢产物如五氯苯酚可导致黄体功能不全、卵泡发育异常等不良后果，损伤卵巢正常功能[17-18]，提示PCNB可通过其在体内的代谢产物对卵巢功能产生不良影响。另外由于生产工艺等的限制，PCNB中会含有微量六氯苯、二噁英等杂质[19-20]，这些杂质可在生物体内蓄积，并影响血清甾体激素水平，干扰大鼠正常发情周期，降低雌性哺乳动物生育力等[21-22]。目前尚不能排除PCNB含有的微量杂质对卵巢功能的影响。此外肝脏作为代谢PCNB的主要脏器，PCNB暴露可造成肝脏损伤[23]，同时肝脏作为多种甾体激素转化、降解的重要器官，它是否参与了亚急性暴露PCNB对甾体激素的影响有待进一步的研究。

综上，本研究发现PCNB亚急性暴露后，可造成大鼠血清孕酮和E2表达水平的变化，并上调大鼠卵巢组织StAR蛋白表达，同时下调芳香化酶蛋白表达，这提示PCNB亚急性暴露可能通过影响甾体激素合成关键酶的表达来影响雌孕激素的分泌，干扰卵巢正常功能，这为探究PCNB对生殖功能的毒性研究提供了新的参考。