Slit2/Robo1与输卵管妊娠患者输卵管中滋养层细胞浸润程度及血管重塑的关系

李莹莹，李彤，李岩，李静雅

(沈阳医学院附属中心医院妇科，沈阳 110024)

异位妊娠(Ectopic pregnancy，EP)是指受精卵在子宫体腔以外着床，是妇产科常见的急腹症之一，也是早期妊娠孕产妇死亡的主要原因。异位妊娠约占所有妊娠的1%～2%，以输卵管壶腹部妊娠最多见[1-2]。妊娠早期孕妇死亡最常见的原因为输卵管妊娠所导致的输卵管破裂出血[3]。与胚胎植入子宫的过程一样，输卵管中存活的胚胎也需要局部血液供应，而血管内皮细胞可促进滋养层细胞浸润输卵管进行血管重塑。滋养层细胞浸润输卵管壁后，可引发一定程度的炎症反应[4]，炎症反应会损伤输卵管上皮纤毛，扰乱输卵管壁的组织结构，从而损害输卵管功能，并导致再次异位妊娠的风险增加。滋养层细胞浸润输卵管的深度决定输卵管的损害程度，然而目前尚缺乏有效的方法评估滋养层细胞浸润输卵管壁的深度。Slit2是Slit蛋白家族成员之一，是一种分泌型糖蛋白，其与跨膜受体Roundabout(Robo)结合可对细胞生长和迁移发挥调节作用[5]。同时Slit2/Robo1信号传导能够促进肿瘤血管的生成，进而促进肿瘤的发生发展[6]。在胚胎发育过程中，人绒毛膜促性腺激素可促进子宫内膜蜕膜化、血管生成、滋养层细胞侵袭，从而有利于胚胎成功着床[7]。滋养层细胞与肿瘤组织具有高度相似的结构和侵袭性，因此，本研究拟初步探索Slit2蛋白、Robo1蛋白与输卵管妊娠中滋养层细胞浸润程度及血管新生的关系，以期为输卵管妊娠的临床治疗提供全新的药物靶点。

资料与方法

一、研究对象

选取2018年5月至2019年3月在我院接受腹腔镜下患侧输卵管切除术治疗的74例输卵管壶腹部妊娠患者的输卵管样本作为实验组。纳入标准：符合输卵管妊娠的诊断标准[8]；术前未接受特殊治疗；肝、肾功能正常且无其他严重合并症；患者及其家属对本次研究内容知情同意。

另从同期接受手术切除治疗的子宫肌瘤或子宫内膜良性病变患者获取正常输卵管标本20例为正常组。纳入标准：术前均未服用过激素类药物和放、化疗；组织学检查输卵管均未见异常。

两组排除标准：(1)合并有盆腔炎性疾病、子宫内膜异位症、卵巢肿瘤等疾病或病史；(2)双胎或多胎；(3)非自然受孕；(4)合并甲亢、风湿性疾病、糖尿病、高血压、心脏病疾病等；(5)近期接受含激素相关药物治疗者。

本次研究已通过我院伦理委员会的批准。

二、研究方法

1.标本切取与镜检分组：收集术中切除的输卵管，采用10%中性福尔马林固定，常规石蜡包埋、切片，切片厚4 μm，取少量切片进行苏木素-伊红(HE)染色。根据滋养层浸润输卵管的深度不同进行组织学分级[9]：滋养层细胞仅浸润输卵管黏膜层为Ⅰ级；滋养层细胞浸润输卵管肌层为Ⅱ级；滋养层细胞浸润整个输卵管壁达浆膜层为Ⅲ级(图1)。根据滋养层细胞浸润输卵管壁的情况将实验组分为Ⅰ级、Ⅱ级和Ⅲ级组。

2.主要试剂及常规溶液配制：兔抗人Slit2单克隆抗体、兔抗人Robo1多克隆抗体、兔抗人CD34单克隆抗体(EPR2999)均购自美国Abcam公司；免疫组化S-P通用型试剂盒购自丹麦DAKO公司，浓缩型DAB试剂盒、多聚赖氨酸、磷酸盐缓冲液(PBS)均购自北京中衫金桥生物技术公司。自配枸橼酸盐缓冲液A液：0.1 mol/L枸橼酸溶液；枸橼酸盐缓冲液B液：0.1 mol/L枸橼酸钠溶液。取9 ml枸橼酸盐缓冲液A液与41 ml枸橼酸盐缓冲液B液，加入450 ml蒸馏水中，配置为工作液。

A：正常；B：Ⅰ级；C：Ⅱ级；D：Ⅲ级图1 滋养层细胞浸润输卵管壁的组织学分级(HE染色 ×40)

3.免疫组化染色：将制好的石蜡切片置于60℃烤箱中2 h，取出切片后依次浸泡于二甲苯、无水酒精、95%酒精和75%酒精各5 min，蒸馏水冲洗后置于PBS缓冲液中。将脱蜡水化后的组织放入已沸腾的柠檬酸盐缓冲液中，煮沸15 min，进行抗原修复。余下操作按照DAB试剂盒说明书进行，Slit2和Robo1的一抗稀释比例为1∶100，CD34一抗稀释比例为1∶200。滴加辣根酶标记抗兔免疫球蛋白G聚合物，置入37℃温箱中孵育20 min。每张切片滴加新鲜配制的DAB溶液覆盖组织，室温下显色3～5 min，苏木素复染30 s，依次置于50%酒精、75%酒精、95%酒精和无水酒精中各5 min，70℃烘箱中烘干。每张切片滴加中性树脂适量，盖玻片覆盖。

4.结果判定：(1)Slit2及Robo1免疫组化的结果判断：由专业的病理人员在不知试验分组的前提下进行结果的判定。阳性染色为细胞质内出现棕色颗粒。染色强度评分标准如下：若着色与背景一致，得0分；若为淡黄色，得1分；若为黄色，得2分；若为棕褐色，得3分。阳性染色细胞数比例评分标准：若阳性染色细胞占所有细胞的百分比<10%为0分；10%～25%为1分；25%～50%为2分；≥50%为3分。两项积分相加，≤2分为阴性，≥3分为阳性表达。阳性表达率=阳性表达数量/总数量×100%。(2)微血管密度(Microvessel density，MVD)检测方法及判定：参照Janik等[10]微血管密度计数标准对CD34免疫组化切片进行检测及判定。切片先在100倍视野下进行观察，选择棕黄色染色最密集的3个区域，转至400倍高倍视野下观看并拍摄，将每个视野血管数量进行统计，相加后求得的平均数即为这张切片的MVD定量数。任何一个与周围组织有明显界限的单个细胞或细胞簇，无论有无血管腔，均视为一个微血管。

三、统计学方法

结 果

一、患者一般情况比较

本研究实验组共纳入74例，其中Ⅰ级组27例、Ⅱ级组29例、Ⅲ级组18例，正常组20例。各组间年龄及孕龄(正常组无孕龄资料)比较均无显著差异(P>0.05)(表1)。

表1 各组一般情况比较(-±s)

二、各组Slit2蛋白和Robo1蛋白表达

Slit2蛋白在实验组EP输卵管组织中(包括Ⅰ、Ⅱ和Ⅲ级亚组)共有35例阳性表达，占47.3%，在正常组输卵管组织中有1例阳性表达；Robo1蛋白在实验组中共有41例阳性表达，占55.4%，在正常组中有2例阳性表达。且Slit2蛋白和Robo1蛋白在Ⅰ级组、Ⅱ级组和Ⅲ级组的阳性表达率呈递增趋势，各组间有显著差异(P<0.05)(表2)。免疫组化图中，正常组无阳性染色，Ⅰ级组可见淡黄色染色且阳性染色面积较小，Ⅱ级组阳性染色面积增大且可见黄色染色，Ⅲ级组大部分组织被染成棕褐色(图2、图3)。

表2 各组Slit2和Robo1蛋白表达的检测结果(%)

左侧栏为各组免疫染色图片(×200)；右侧栏为左侧栏各组相应框区放大图像(×400)图2 各组输卵管组织Slit2蛋白表达(免疫组化染色)

左侧栏为各组免疫染色图片(×200)；右侧栏为左侧栏各组相应框区放大图像(×400)图3 各组输卵管组织Robo1蛋白表达(免疫组化染色)

三、各组MVD计数比较

正常组、实验组输卵管组织中(Ⅰ级组、Ⅱ级组和Ⅲ级组)的MVD计数，两两比较均有显著差异，且浸润分级越高，MVD计数越大(P<0.05)(表3、图4)。

表3 各组MVD计数比较(-±s)

四、Slit2蛋白与Robo1蛋白表达的相关性

相关性分析表明EP输卵管组织中Slit2蛋白与Robo1蛋白表达呈正相关性(r=0.603，P<0.001)(表4)。

表4 异位妊娠输卵管Slit2蛋白和Robo1蛋白表达的相关性

五、Slit2蛋白和Robo1蛋白表达与MVD计数的相关性

在EP输卵管组织中，Slit2表达阳性者MVD计数显著高于Slit2表达阴性者(P<0.05)；Robo1表达阳性者MVD计数显著高于Robo1表达阴性者(P<0.05)(表5)。经Spearman相关性分析显示，Slit2的阳性表达以及Robo1的阳性表达均与MVD计数呈正相关性(rSlit2=0.846，rRobol=0.729，P<0.001)。

左侧栏为各组免疫染色图片(×200)；右侧栏为左侧栏各组相应框区放大图像(×400)图4 各组输卵管组织CD34-MVD计数(免疫组化染色)

表5 不同Slit2蛋白和Robo1蛋白表达情况的EP输卵管中MVD计数比较(-±s)

讨 论

近年来，随着临床生殖道感染、输卵管手术、盆腔炎、辅助生殖、宫内节育器以及流产等病例的不断增加，EP发病率不断上升并呈现年轻化趋势，其中输卵管壶腹部妊娠始终占较大比例。O’Donnell等[11]曾报道，输卵管妊娠以壶腹部妊娠最多见，壶腹部妊娠约占异位妊娠患者的72.5%。这也是本研究将输卵管壶腹部妊娠作为研究对象的重要原因。近年来，由于医疗技术的逐渐发展，EP得到更及时的诊断，患者的存活率和生育力保留也有了一定程度提高。但因为输卵管壁受滋养层细胞浸润较深，且滋养层细胞通常难以彻底清除，故保守治疗成功率低、复发率较高[12]。从某种意义而言，了解滋养层细胞浸润深度应被视为对此类患者实施临床治疗的重要依据，并在此基础上进一步明确EP对输卵管形态和功能的损害程度，尤其对有再次妊娠意愿的患者，选择恰当的治疗方案，从而避免切除过多的组织并改善生殖预后具有重要意义。但当前除手术病理外，在术前能对滋养层细胞浸润深度做出客观并有效的评价的指标还比较匮乏。

Slit/Robo信号系统最早作为中枢神经系统发育过程中轴突导向抑制因子而被发现[13]。Slit 蛋白家族成员分别较广，不仅在中枢神经系统与血管内皮细胞等正常的组织中表达，在多种肿瘤组织中也有表达[14-16]。Slit2是Slit蛋白家族成员之一，是一种分泌型糖蛋白。Slit的4种受体包括Robo1、Robo2、Robo3和Robo4，皆可与Slit2结合发挥生物学作用。研究发现，Slit/Robo信号系统与肿瘤的发生、发展关系密切，有望成为肿瘤诊断、治疗的潜在靶点[5]。近些年来有关Slit/Robo的研究表明，Slit/Robo信号传导在生殖系统中仍起到了重要作用，可调节成人生殖细胞的生理功能，对子宫内膜、卵巢及输卵管组织的生理功能起到了重要的作用[17]。其中，Slit2/Robo1信号被认为在妊娠期间的滋养层细胞功能中发挥重要作用。Li等[18]的研究发现，EP输卵管的绒毛外滋养层中Slit2和Robo1均有表达。在本研究中我们进一步发现，Slit2蛋白与Robo1蛋白在EP输卵管组织中阳性表达率分别为47.3%和55.4%，且二者的阳性表达率均随滋养层细胞浸润输卵管壁的组织学分级同步增高。该结果提示Slit2蛋白、Robo蛋白的高水平表达可能预示滋养层细胞浸润输卵管壁的程度较深，而由此导致的输卵管功能损害程度也越大。

在所有哺乳动物的妊娠组织中都有着较丰富的血管网，这些新生的血管无论在正常状态下还是在病理状态下均受到严格的调控。Slit/Robo信号系统可通过参与内皮细胞的迁移来调控妊娠组织中的血管网络。Liu等[19]研究发现，Slit/Robo信号系统与血管重塑有关，Slit2与Robo1蛋白结合形成复合物，通过肌动蛋白细胞骨架传递信号，进而诱导丝状伪足的形成，引起内皮细胞的迁移，这被认为是血管重塑过程中的基本事件。张学敬等[20]研究发现在小鼠月经周期中Slit与Robo的表达也不同，其中Slit2和Robo1在小鼠卵巢组织，主要是黄体细胞中高表达，且晚期黄体Slit2和Robo1 mRNA的表达水平均显著上调(P<0.05)；阻断Slit/Robo信号通路后，晚期黄体细胞的凋亡率显著下降(P<0.05)，说明Slit/Robo家族成员主要参与调控黄体细胞的凋亡过程。Shen等[21]通过比较正常女性和子宫内膜异位症患者的子宫内膜发现，后者Slit、Robo1表达上调，提示Slit过表达能够诱导异位的子宫内膜血管新生。此外，在哺乳动物眼角膜及鸡胚尿囊绒膜组织中，Slit/Robo均可调节血管新生，并已得到实验证实[22-23]。由此可见，Slit/Robo广泛参与了机体组织和器官的血管重塑过程。但Slit/Robo对EP输卵管中血管重塑的影响尚未见文献报道。本研究结果显示，正常输卵管组织以及Ⅰ、Ⅱ、Ⅲ级滋养层细胞浸润的输卵管组织的MVD计数逐渐升高，提示浸润分级越高，血管重塑越活跃。且Slit2或Robo1表达阳性组的MVD计数高于对应表达阴性组的MVD计数，提示血管重塑与Slit2蛋白、Robo1蛋白表达水平密切相关。

综上所述，本研究结合免疫组化等技术手段，证实了在EP输卵管组织中，Slit2蛋白和Robo1蛋白的表达随滋养层细胞浸润分级的升高而增加，并提示Slit2蛋白和Robo1蛋白可能具有促进血管新生的作用。然而本研究尚存在某些局限性，本阶段试验还不能对Slit2/Robo1信号在输卵管组织新生血管的进程中差异表达的信号诱导机制以及促进血管新生的机制做出解释。此外，Slit2和Robo1蛋白在非妊娠输卵管中也有少量阳性表达，目前考虑Slit2和Robo1蛋白并非滋养层细胞特异性表达，但正常妊娠是否影响输卵管组织中Slit2和Robo1蛋白的表达、HCG的变化是否对其表达具有影响，这些疑问将在后续的研究中进一步探明。